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时间:2023-12-09 17:46:16
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【关键词】:细胞毒性;骨水泥;组织相容性;MTT法
骨粘固剂,常用名为骨水泥,其主要成分是聚甲基丙烯酸甲酯。1951年,瑞典Klaer用PMMA作为髋关节假体固定材料;1988年Charnley深入研究并推广使用,从而使骨粘固剂固定假体置换获得成功;我国从1978年研制成功并应用与临床,主要用于人工关节置换手术。应用MTT法检测细胞的活性是近年来评价生物相容性的一种简便、高效的方法。本试验旨在通过对两种国产骨水泥的细胞毒性试验的研究,阐述其应用的安全性。
1.试验材料 1.1 实验材料和对照品
试验选取某国产骨水泥及同厂家带庆大霉素的骨水泥。骨水泥的组成为:粉剂20g(聚甲基丙烯酸甲酯 17.60g,硫酸钡2.00g,过氧化苯甲酰0.40g);液体 10ml(甲基丙烯酸甲酯 9.87ml,对苯二酚 75ppm,N,N二甲基对甲苯胺
供试品的制备:室温下,在无菌条件下将粉剂倒入骨水泥搅拌器中,然后将液体倒入粉剂中,充分搅拌约1.5min,混合均匀后等待3-5分钟后放入样品容器。称取两种骨水泥的重量,按照0.2g/ml的浸提比例,加含10%血清的MEM培养基为浸提介质,制成浸提原液。阴性对照组:按照6cm2/ml的比例,取24cm2高密度聚乙烯,加4.00mL浸提介质。阳性对照组含5% DMSO的浸提介质。 1.2 菌株和细胞
小鼠成纤维细胞,购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(NCTC clone-929)。
1.3培养基及试剂
胎牛血清(Gibco公司)10%;MEM培养基干粉(Gibco公司)配置成原液;四唑盐(MTT)生工生物工程(上海)有限公司5g/L ;二甲基亚砜(DMSO)Merck公司5% ;胰酶溶液(Gibco公司)0.25% ;双抗(10000U/mL)Gibco公司1%。
2.试验方法
细胞毒性试验―MTT法[2,3]
2.1 在无菌的条件下,取供试样品制备浸提液。分别取供试品骨水泥及庆大霉素骨水泥4g,按照0.2g/ml的浸提比例,加浸提介质20mL,制成浸提原液。
阴性对照组:按照6cm2/ml的比例,取24cm2高密度聚乙烯,加4.00mL浸提介质。
阳性对照组: 含5% DMSO的浸提介质。浸提温度为37℃,浸提时间为24 h。
2.2 接种细胞:将传代48~72h生长旺盛的细胞,经2.5g/L胰酶溶液消化制成浓度为 1×104 个/mL的细胞悬液接种于96孔板,设空白对照、阴性对照、阳性对照和供试品浸提原液组,每组均为12孔,每孔接种100?L细胞悬液,置37℃、5%CO2培养箱内培养24h。
换液培养:24h后,弃去原培养液,空白组加入细胞培养液,阴性对照组加入高密度聚乙烯浸提液,阳性对照组加入含5%DMSO的培养液,供试品组加入浸提原液,每孔100?L,置37℃、5%CO2气体培养箱内继续培养 72 h。结果测定:经接触培养后,置显微镜下观察细胞形态。每孔加入20?L质量浓度为5g/L MTT溶液,继续培养4h后弃去孔内液体,加入150?L DMSO,置振荡器上振荡10min,在酶标仪570nm和630nm波长下测定吸光度。
3.数据统计及试验结果:
3.1空白对照组、阴性对照组、供试品浸提原液组及阳性对照组的吸光度采用双波长法测定(570nm-630nm)。
3.2计算公式:相对增殖率(RGR)=试验样品组吸光度/空白对照组吸光度×100% 3.3结果评定: 按照GB-T/14233.2-2005医用输液、输血、注射器具检验方法第二部分:生物学试验方法的细胞相对增殖率分级标准作为判定依据。
阴性对照的反应不大于1级,阳性对照组至少为3级反应。如阴性对照和阳性对照组反应不成立时应重新试验。
4.试验结果
MTT比色法结果如下:
根据本实验结果进行结果分级:庆大霉素骨水泥的细胞相对增殖度为2级(74.1%),骨水泥的细胞相对增殖度为2级(61.4%)。结果判定为:反应观察至多50%的细胞呈圆形,无胞浆内颗粒;明显可见细胞溶解和细胞间空区。
按照GB/T 14233.2-2005检验医疗器械时,一般认为可接受的细胞毒性反应为不大于2级。
5.讨论
骨水泥需要长期与人体骨组织接触, 其组织相容性的优劣直接影响临床疗效,对骨水泥的生物安全性研究主要是按照ISO10993标准所规定的生物安全性评价方法进行的,按照GB/T 16886.3的要求,作为植入类材料骨水泥必须按照相关安全性检验标准进行完整生物学评价[1-3]。其中体外细胞毒性实验是评价材料生物相容性最基础、最经济便利的步骤。它可以快速、方便地了解细胞和受试材料接触后发生的生长抑制、死亡等反应,在评价生物相容性方面得到广泛认同。
在本次试验中,浸提原液中含庆大霉素的骨水泥及不含抗生素的骨水泥都表现出轻微细胞毒性,50%稀释液都为极轻的细胞毒性,均在GB-T 14233.2-2005的可接受范围内。由于MMA单体是造成细胞毒性的主要因素[4],所以在制备骨水泥的过程中一定要注意搅拌均匀,充分放热后再进行浸提,以免影响试验的准确性。本试验表明抗生素对骨水泥的细胞毒性并没有产生太大的影响,两种骨水泥与细胞的相容性较好,符合生物医用材料的基本要求[3]。
参考文献:
[1]医疗器械生物学评价[S].第5部分:体外细胞毒性试验,2003
[2]医用输液、输血、注射器具检验方法[S].第2部分:生物学试验方法,2005