细胞增殖论文精品(七篇)

序论：写作是一种深度的自我表达。它要求我们深入探索自己的思想和情感，挖掘那些隐藏在内心深处的真相，好投稿为您带来了七篇细胞增殖论文范文，愿它们成为您写作过程中的灵感催化剂，助力您的创作。

篇(1)

【关键词】人乳铁蛋白；癌细胞；细胞增殖

人乳铁蛋白(HumanLactoferrin，hLF)是主要存在于人乳清中的球蛋白，乳汁别是初乳中含量最高，具有广谱抗菌、抗病毒、抗肿瘤等作用。国外有学者将其应用于肿瘤患者的治疗，但是对其作用机制的研究较少。目前国内较少有关于hLF作用于细胞的报道，我们选用易早期转移的鼻咽癌(NPC)细胞作为研究对象，以中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、人肝脏细胞(L02)作为正常细胞对照，观察hLF在体外是否具有抑制癌细胞生长的作用，探讨hLF抗肿瘤的作用机制，从而为肿瘤的治疗提供研究基础，为临床实验及应用提供新的理论依据。

一、材料与方法

1.1材料人鼻咽癌细胞(CNE)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、人肝脏细胞(L02)均购自中国科学院上海细胞资源中心。重组hLF(Lot:L0520，溶于PBS中，储存浓度5mg/ml，-20℃储存备用)和噻唑蓝(MTT，Lot:M2128)均购自Sigma公司。RPMI1640、胎牛血清购自HyClone公司。其他试剂均为分析纯。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养各细胞系均应用含10%胎牛血清和1%青链霉素的RPMI1640培养基，5%CO2，37℃培养。

1.2.2MTT法检测细胞增殖设空白对照组和hLF干预组。待细胞生长至对数生长期，接种于96孔细胞培养板，接种数为5×104/孔。每组细胞设5个平行孔，各组细胞分别加入不同浓度的hLF(0，1.25×10-3,2.5×10-3，5×10-3，10×10-3，20×10-3，40×10-3g/L)，每孔均为200μl。作用24h后，加入MTT(5g/L，每孔20μl)，继续培养4h，测定A570nm吸光度。

1.2.3细胞形态观察细胞经hLF处理后，倾去上层悬浮死细胞并用PBS洗两遍，加入新鲜培养基。同样处理对照孔细胞，将细胞置于倒置显微镜下，观察细胞形态的变化。

1.3统计学处理数据用x±s表示，组间比较用方差分析。

二、结果

2.1重组hLF对鼻咽癌细胞CNE、人肝脏细胞L02、中国仓鼠细胞CHO系的增殖能力的影响对CNE呈现剂量依赖性的抑制作用，而对正常细胞无抑制作用。人乳铁蛋白对各细胞体外增殖的影响与空白对照比较:1)P<0.05

2.2细胞形态学观察显微镜镜下可见，空白对照组癌细胞密集成片生长，如铺路卵石状，细胞膜圆润，透明，颗粒较少，细胞间界限清楚，并可隐约见到细胞核。hLF处理组癌细胞形态发生明显的改变，随hLF浓度增加，细胞从正常的增殖旺盛的贴壁生长，逐渐表现为生长缓慢，黏附力降低，细胞变圆，细胞胞质粗糙，细胞内颗粒逐渐增多，且透明度降低，立体感较差，细胞形态完整性受损，而正常细胞在细胞镜检图hLF作用下无显著变化。

三、讨论

hLF多种生物学功能通过免疫系统的激活与调节得以实现。Bezaul研究发现，乳铁蛋白能抑制鼠实体瘤的生长和转移。肿瘤内注射LF，可以明显的减小实体瘤的体积，且作用效果与LF干预天数相关。研究发现，乳铁蛋白的抗头颈部肿瘤作用是通过抑制肿瘤细胞增殖实现的。Wolf等发现，人乳铁蛋白通过阻断头颈部肿瘤细胞由G0到G1期的转化来抑制肿瘤细胞的增殖。人乳铁蛋白对鼠的SCC细胞系生长的抑制作用，与剂量成正相关；而且人乳铁蛋白抑制头颈部细胞癌的作用是通过直接的细胞毒作用及系统性的免疫调节作用实现的。

Varadhachary等人做了大量的口服临床试验，证实乳铁蛋白无药物相关的有害作用。鼻咽癌作为头颈部肿瘤之一，其恶性程度较高，早期即可出现颈部淋巴结转移，临床上有转移至骨盆、肺、肝等多器官的病例。选用鼻咽癌细胞作为研究对象，具有一定的代表意义。

本研究结果显示，人乳铁蛋白可以抑制鼻咽癌细胞增殖，且呈剂量依赖性，对正常细胞的增殖无明显抑制作用。这一结果，为开发乳铁蛋白的抗癌功效提供了理论依据。

【参考文献】

篇(2)

MAPK信号通路在多种恶性肿瘤（包括卵巢癌）细胞的增殖、凋亡和化疗药物作用及化疗药物耐受发生中起重要作用[4-6]。MAPK家族包括p38 MAPK、细胞外信号调节蛋白激酶（ERK）、c-jun氨基末端激酶（JNK）等多个亚家族。这些亚族组成多条信号通路，其中最主要的有P38途径、ERK1/2途径和JNK途径。MAPK家族成员被磷酸化激活后，将细胞外的各种刺激信号传递到细胞内，引起细胞内级联反应，调节细胞的增殖、凋亡及对药物的敏感性[7]。有研究发现激活的AKT和MAPK，依次磷酸化BAD和BCL-2，进而削弱铂类和紫杉烷的促进细胞凋亡作用[8]。笔者前期研究发现MAPK信号通路在晚期上皮性卵巢癌组织中异常激活，并发现磷酸化p38 MAPK在耐药卵巢癌组织中表达较非耐药卵巢癌组织中升高。

二甲双胍是一种用于治疗2型糖尿病的双胍类降糖药，最近两项大型流行病学调查研究表明：长期服用二甲双胍能够降低卵巢癌的发病率，而且二甲双胍能够显著延长卵巢癌合并糖尿病患者的无进展生存期[9]。二甲双胍通过STK11（也称LKB1）激活AMPK，激活过程涉及多个参与细胞增殖调节的信号通路，其中包括MAPK信号通路[10]。但二甲双胍是否能够增加化疗药物对卵巢癌细胞的敏感性及相关的作用机制研究尚属空白。

本研究首先观察二甲双胍对卵巢癌细胞增殖的影响，以及二甲双胍是否可增强顺铂的化疗敏感性，并通过检测二甲双胍对化疗药物相关的重要信号通路MAPK信号通路的调节作用来探讨相关的作用机制。以期寻找能提高卵巢癌化疗敏感性的新的治疗方案。

1 材料与方法

1.1 细胞系和试剂 人卵巢浆液性状囊腺癌细胞系SKOV3，中、高分化，贴壁生长，购于中国医学科学院细胞库，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。细胞系常规3～5 d传代。兔抗人p38 MAPK多克隆抗体、兔抗人P-p38 MAPK单克隆抗体；兔抗人AMPK多克隆抗体、兔抗人P-AMPK单克隆抗体，兔抗人GAPDH单克隆抗体购自Cell signaling公司；二甲双胍、顺铂购自美国Sigma公司，胎牛血清购自杭州四季青公司；Western blotting检测试剂盒购自武汉博士德公司；Trizol 试剂购自美国Invitrogen公司；BrdU标记及检测试剂盒购自德国Roche公司。

1.2 方法

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行处理，组间差异采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 二甲双胍抑制卵巢癌细胞增殖的情况 二甲双胍能够抑制卵巢癌细胞增殖，并且这种抑制作用能够被Compound C所削弱。随着二甲双胍浓度（1×10-3 mol/L，1×10-4 mol/L，1×10-5 mol/L）的增加，其对卵巢癌细胞SKOV3增殖的抑制作用逐渐增强（*P<0.05，**P<0.01）。其中1×10-4 mol/L

和1×10-5 mol/L的二甲双胍能够显著抑制子宫内膜癌细胞的生长。而AMPK阻断剂Compound C（5×10-7 mol/L，1×10-6 mol/L）均可削弱二甲双胍的这种抑制卵巢癌细胞增殖的作用。1×10-6 mol/L Compound C与二甲双胍联合应用，其对卵巢癌细胞增殖的抑制作用与空白对照组比较差异无统计学意义（P>0.05），见图1。

2.2 二甲双胍能够增强卵巢癌对顺铂的敏感性 将不同浓度的顺铂（1、2、4、6 ng/L）加入卵巢癌细胞SKOV3中，加入或者不加入0.1 mM二甲双胍孵育细胞48 h后，结果表明：0.1 mM的二甲双胍联合顺铂（1、2、4、6 ng/mL）作用于卵巢癌细胞时，顺铂抑制卵巢癌细胞生长的作用显著增强（P<0.05）。其中6 ng/mL顺铂联合0.1 mM的二甲双胍对卵巢癌细胞的抑制作用最显著（P<0.05），见图2。

2.3 二甲双胍联合p38 MAPK阻断剂SB203580能够增强二甲双胍的抗卵巢癌细胞增殖的作用 单独应用SB203580（5[dylw.net提供专业写作论文和服务.]、10 ?M）能抑制卵巢癌SKOV3的增殖，差异有统计学意义（P<0.05）。二甲双胍（0.1 mM）和SB203580（5、10 ?M）联合应用对卵巢癌细胞SKOV3增殖的抑制作用显著增强（*P<0.05，**P<0.01）。其中0.1 mM二甲双胍与10 ?M p38 MAPK阻断剂SB203580联合应用对卵巢癌细胞SKOV3增殖的抑制作用最显著（**P<0.01），见图3。

2.4 二甲双胍激活AMPK信号通路，并抑制MAPK信号通路 二甲双胍（10、20 mM）作用卵巢癌细胞SKOV3 6 h后，磷酸化AMPK水平显著增高，且升高的磷酸化AMPK水平能够被AMPK阻断剂Compound C所削弱。经二甲双胍（1、10 mM）处理后，卵巢癌细胞SKOV3中磷酸化p38 MAPK蛋白水平显著降低，见图4。

3 讨论

最近两项大型流行病学资料显示：（1）长期服用二甲双胍可降低卵巢癌的发病风险；（2）在合并糖尿病的卵巢癌患者中，服用二甲双胍的患者较未服用患者的无病进展存活率显著增加[10-11]。笔者研究结果发现，二甲双胍能够抑制卵巢癌细胞增殖，这种作用是通过激活AMPK信号通路实现的。AMP激活蛋白激酶（AMPK）是主要的细胞能量调节器，是代谢和肿瘤互相作用的主要调节子[11]。二甲双胍以一种非胰岛素介导的方式直接调节细胞增殖和凋亡，二甲双胍通过激活AMPK，激活的AMPK调节多个信号通路，其中包括mTOR和MAPK信号通路，最终调节细胞增殖和凋亡。

化疗药物引起的细胞损伤主要是通过、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路实现的，并且化疗药物耐受的形成也与MAPK信号通路激活密切相关[6]。MAPK家族包括P38MAPK、细胞外信号调节蛋白激酶（ERK）、c-jun氨基末端激酶（JNK）等多个亚家族。这些亚族组成多条信号通路，其中最主要的有P38途径、ERK1/2途径。MAPK信号通路在多种恶性肿瘤（包括卵巢癌）细胞的增殖、凋亡和化疗耐药产生过程中发挥重要作用[6]。MAPK家族成员被磷酸化激活后，将细胞外的各种刺激信号传递到细胞内，引起细胞内级联反应。有研究发现激活的MAPK，依次磷酸化BAD和BCL-2，进而削弱铂类和紫杉烷的促进细胞凋亡作用，使肿瘤细胞对化疗药物产生抵抗[12]。笔者的研 究结果表明：二甲双胍可能通过激活AMPK信号通路，进而抑制MAPK信号通路来抑制卵巢癌细胞增殖的。这与以上研究结果相一致。

笔者的研究结果还发现：二甲双胍（0.1 mM）能够增强顺铂抑制卵巢癌细胞增殖作用。与最近的几项研究结果一致：二甲双胍能改善乳腺癌化疗耐药，并且发现二甲双胍的这种对化疗耐药的调节作用是通过激活AMPK实现的[13]。Tseng等[16]在非小细胞肺癌细胞中发现二甲双胍不仅能够降低紫杉醇诱导p38 MAPK介导的切除修补基因（ERCC1）的表达，还能够增加紫杉醇诱导的细胞毒效应。另外在肺癌、乳腺癌和前列腺癌裸鼠体内模型中，二甲双胍能够显著增强顺铂、紫杉醇和多柔比星对肿瘤细胞生长的抑制作用，并且二甲双胍能够减少多柔比星的用量，延长疾病缓解期[14-15]。但这些结果说明二甲双胍可能通过激活AMPK调节肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。

笔者同时发现，二甲双胍联合MAPK信号通路抑制剂能够增强二甲双胍的抗肿瘤作用。p38 MAPK、p42 MAPK信号通路抑制剂可增加二甲双胍和紫杉醇的抗肿瘤作用[16]。Liu等[17]在乳腺癌中发现二甲双胍和mTOR抑制剂（RAD001）联合可增强化疗药物的细胞毒作用，联合应用二甲双胍、化疗药物和mTOR阻断剂能够[dylw.net提供专业写作论文和服务.]协同抑制乳腺癌细胞增殖。Monteagudo等[18]在前列腺癌细胞中，p42 MAPK siRNA能够显著增强二甲双胍的抗肿瘤作用。因此，铂、紫杉醇化疗的基础上联合二甲双胍和信号通路阻断剂可能会增强卵巢癌化疗的疗效，这些研究结果都与笔者的研究结果一致。

总之，二甲双胍能够提高卵巢癌细胞系SKOV3细胞对顺铂的敏感性，并且这种作用是依赖于AMPK激活的；p38 MAPK阻断剂SB203580也能够抑制SKOV3的增殖，二甲双胍能够增强这种抑制作用。二甲双胍的这种增强卵巢癌细胞对顺铂敏感性的作用可能是通过激活AMPK，从而抑制MAPK信号通路实现的。笔者的研究结果为临床应用二甲双胍及MAPK信号通道阻断剂来提高卵巢癌化疗药物的敏感性提供理论支持，为卵巢癌的临床联合用药提供新思路。

参考文献

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篇(3)

论文摘要 目的：探讨糖尿病足中医辨证分型与血管细胞核增殖相关抗原的表达差异。方法：对32例截肢的糖尿病足患者按中医辨证分为气血两虚瘀阻证、脉络瘀热证、脉络热毒证和气阴两虚瘀阻证，分别对其截肢肢体的胫后动脉应用免疫组化法对细胞核增殖相关抗原（Ki67）的表达进行观察、分析。结果：Ki67的阳性表达与糖尿病足动脉硬化闭塞程度呈负相关，与血管炎症病变程度呈正相关。结论：炎症在糖尿症的大血管病变的过程中起到了重要的作用。

糠尿病足是糖尿病的严重并发症，据统计1996年全球糖尿病患者1．2亿，预计到2025年，将达到2．5亿以上，而大约15％的糖尿病患者将在其生活的某一时间发生足溃疡或坏疽[1]。目前对于糖尿病足病因及发病机制虽然还不是完全清楚，但大家公认糖尿病合并大血管病变导致动脉粥样硬化是糖尿病足发病的最主要因素。现将2004年10月～2005年5月间我们收治的32例糖尿病足患者的截肢动脉标本的血管细胞核增殖相关抗原(Ki67)与其中医辨证分型的相关性研究情况报告如下。

1 临床资料

1．1 一般资料：32例均为天津医科大学代谢病医院和天津中医学院第一附属医院2004年10月～2005年5月间的住院患者，其中男性24例，女性8例；年龄50～86岁，平均年龄69．2岁；糖尿病病程最长30年，最短6年，平均18±2．4年。

1．2 诊断标准：糖尿病足的诊断标准采用2000年中华医学会糖尿病学会第二届糖尿病足会议所制订的“糖尿病足(肢端坏疽)检查方法及诊断标准”。

1．3 截肢标准：参照国际糖尿病足工作组编写的《糖尿病足国际共识》中关于“大截肢的定义、标准和指标”[2]执行。

1．4 中医辨证分型标准：参照《中医外科学(第七版)》及《中药新药临床研究指导原则·脱疽》之中医辨证分型方案分为气阴两虚瘀阻证、脉络瘀热证、气血两虚瘀阻证、脉络热毒证四型。

2 观察方法

2．1 标本取材：坏疽截肢标本32例，其中按中医辨证分型气血两虚瘀阻组10例，脉络瘀热组10例，气阴两虚瘀阻组4例，脉络热毒组8例，取各例标本下肢胫后动脉。标本经过10％福尔马林固定，常规石蜡包埋，备用。

2．2 设备、试剂：美国PENGUIN-600CL自动图像分析系统，细胞核增殖相关抗原(Ki67)抗体PV9000试剂盒DAB购于北京中山生物技术有限公司。

2．3 免疫组织化学法：标本常规石蜡包埋，4μm连续切片，采用PV法进行免疫组化染色，染色过程严格按试剂盒染色程序进行，选取已知的阳性切片作阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。观察细胞核增殖相关抗原(Ki67)，阳性物质呈棕黄色细颗粒状于细胞核表达，采用美国PENGUIN-600CL图像分析系统进行图像分析，选取病变处每500个细胞Ki67的阳性表达率作为其阳性表达指数。统计学处理应用SPSS10．0软件包进行方差分析。

3 结果

3．1 中医各证型所占比例以及年龄、性别分布：各证型比例，气血两虚瘀阻组10例（31．25%），脉络瘀热组10

例（31．25%），气阴两虚瘀阻组4例（12．5%），脉络热毒组8例（25．0%）。年龄、性别分布情况，见表1。

表1 32例患者年龄、性别分布 n（%）

性别n50~60岁61~70岁71~80岁80岁以上男24（ 75．0）4（12．5） 8（25．0）11（34．4）1（3．1）女 8（ 25．0）1（ 3．1） 3（ 9．3） 4（12．5）0 总计32（100．0）5（15．6）11（34．4）15（46．9）1（3．1）3．2 免疫组织化学法观察各证型Ki67表达差异：具体情况见表2。

表2 各证型Ki67阳性表达指数比较 （%）

证型Ki67阳性表达指数脉络热毒 4．87±1．01*气阴两虚瘀阻1．86±0．47脉络瘀热1．49±0．13气血两虚瘀阻0．30±0．18注：与气血两虚瘀阻型比较，*P

气血两虚瘀阻证、脉络热毒证、脉络瘀热证、气阴两虚瘀阻证中均可见部分细胞Ki67呈阳性表达，在脉络热毒证中表达指数最高，气血两虚瘀阻证中表达指数最低，二者比较具有显著性差异(P

4 讨论

Ki67抗原为细胞核内与细胞分裂增殖相关的蛋白抗原，分子量为345kd和395kd，其编码基因位于第10号染色体上。Ki67的表达出现于G1中期到晚期，S期和G2期逐渐增加，有丝分裂期达高峰，分裂后迅速降解或丢失抗原决定簇，到G0期则不表达，半衰期为lh或更短[3]。有人认为它可能是具有蛋白结合特性的重要结构，在有丝分裂中起着维持DNA规则结构的重要作用[4]，是一个反映细胞增殖的敏感指标。

在糖尿病足的不同辨证分型中气血两虚瘀阻证、脉络热毒证、脉络瘀热证、气阴两虚瘀阻证中Ki67表达均呈阳性，在脉络热毒证中表达最强、气血两虚瘀阻证中表达最弱，二者相比具有显著性差异(P＜0．05)。根据Ki67阳性指数可以判断细胞增殖的活性，指明细胞增殖与糖尿病足动脉病变的关系。在糖尿病足的不同辨证分型中动脉的硬化闭塞程度由轻到重依次是脉络热毒证、气阴两虚瘀阻证、脉络瘀热证、气血两虚瘀阻证。Ki67的阳性表达与糖尿病足动脉硬化闭塞程度呈负相关。而在通过对32例糖尿病足截肢的动脉进行病理学观察的过程中发现糖尿病足血管病变主要体现在中动脉的病理学变化，其中脉络热毒、气阴两虚瘀阻两证型以动脉周围及全层的炎症性改变为主；脉络瘀热、气血两虚瘀阻证以中膜钙化、平滑肌细胞萎缩、变性、坏死及胶原纤维增多及内膜粥样斑块形成为主，炎症表现不明显；而Ki67的阳性指数与血管炎症病变程度呈正相关。这说明炎症在糖尿病的大血管病变的过程中起了重要的作用，特别是在脉络热毒证、气阴两虚瘀阻证两型，这对临床具有重要的指导意义。

5 参考文献

1 Boulton A J. The diabetic foot：a global view. Diabetel Metab Res Rev，2000，16(1)：2．

2 许樟荣，敬华．糖尿病足国际共识．中华糖尿病学会第二届足病第一次足病研讨会．2002，435．

篇(4)

关键词：醇提物、细胞毒、MKN-28、SMMC-7721

中图分类号：R9694文献标识码：A

文章编号：1007-2349（2013）02-0048-02

恶性肿瘤严重的威胁着人类生命和健康，其发病率和死亡率在世界许多国家和地区居首位。据WHO预测，到2020年全球肿瘤发病率将上升50%，癌症病人将增加的近1500万，恶性肿瘤将成为21世纪危害人类健康的头号杀手。目前已上市的抗肿瘤药物缺乏细胞毒性特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时，往往无选择地杀伤正常细胞，特别是增生活跃的造血干细胞，正常细胞的损伤常导致严重的并发症，影响治疗效果和患者依从性。而近年来，从天然药物中寻找高效低毒的抗肿瘤药物成为研究热点[1]。

景洪哥纳香系蕃荔枝科哥纳香属植物，全世界约50种，分布于热带及亚热带地区[2]。我国产10种，分布于西南、华南、台湾等省区。在民间主要用于清热、杀虫、抗癌、抗疟等[3]。笔者通过体外观察景洪哥纳香醇提物对两株人肿瘤细胞株的抗增殖作用，初步判断其抗肿瘤活性。为将景洪哥纳香抗肿瘤活性的进一步研究提供必要的前期基础。

1材料与方法

11材料人胃癌细胞MKN-28、人肝癌细胞SMMC-7721购自于中国科学院上海细胞库；RMPI-1640培养基购自于GIBCO公司；新生牛血清购自于杭州四季青试剂公司；胰蛋白酶、二甲基亚砜（DMSO）、噻唑蓝（MTT）购自于Sigma公司；三联液（10mL SDS，5mL异丁醇，012mL HCL，定容至100mL）由实验室自己配置。注射用青霉素钠、注射用硫酸链霉素购自于大连美罗大药厂。

12细胞培养用RPMI-1640培养液含10%新生牛血清、100 kU/L青霉素、100 kU/L链霉素，在37 ℃、5 %的二氧化碳培养箱中常规培养，25 g/L胰酶+02 g/L EDTA消化传代，取对数生长期的细胞用于实验。

13体外抗增殖作用采用改良MTT法，取对数生长期的细胞，以4×104/mL、90 μL /孔接种于96孔板中，分别加入阴性对照组生理盐水（NS）、阳性对照组（终浓度为01、1、10 μg/mL的顺铂）及终浓度分别为1、3、10、30、100 μg/mL的各种景洪哥纳香醇提物，每个浓度均设4个平行孔，于37℃、5%CO2培养箱内培养48 h，每孔加入5 g/ L MTT 10 μL，振荡混匀，4h后，每孔加入100 μL三联液，12 h后，轻轻振荡15 min，在酶标仪上于490 nm/570 nm双波长下测定OD值，计算细胞增殖抑制率：

细胞抑制率=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%

并利用Gwbasic软件计算半数抑制浓度（IC50）。

2结果

21形态学观察不同浓度的景洪哥纳香醇提物用于两种人肿瘤细胞48h后，光学显微镜下观察可见细胞增殖被显著抑制（见图1、图2）。高浓度景洪哥纳香醇提物与正常组比较，细胞贴壁能力下降，由不规则形状逐渐变圆、皱缩、折光性降低，细胞数量显著减少，可见大量细胞碎片。且发现景洪哥纳香醇提物对两株人肿瘤细胞增殖抑制能力有一定的剂量依赖性。

22体外细胞增殖抑制作用改良MTT法观察景洪哥纳香醇提物对细胞的细胞毒作用，发现景洪哥纳香醇提物在一定的剂量范围内，可以显著的抑制MKN-28细胞的增殖能力，且具有显著的剂量依赖性，其IC50为3102μg/mL。而其对SMMC-7721同样具有显著的细胞毒作用，但是剂量依赖性不明显，其IC50为1888μg/mL。观察发现，100μg/mL景洪哥纳香醇提物对这两株人肿瘤细胞增殖抑制率可达95%以上。随着浓度的降低，其细胞毒作用也逐渐降低。（见图3）

3讨论

中医药在治疗癌症方面有其独到之处。近年来，从中药中筛选抗癌活性成分以及抗癌先导化合物已成为这一领域研究的热点。据不完全统计，来源于植物药的抗癌制剂，占总抗癌药的1/3左右[4]。紫杉醇、喜树碱、长春新碱等已作为许多肿瘤的首选药。我国的药用植物种质资源丰富，如果能将中药中抗肿瘤有效成分分离出来，明确其抗肿瘤作用及机理，对于抗肿瘤药物的研制开发以及肿瘤治疗具有非常重要的意义。[JP]

番荔枝科属植物抗肿瘤活性显著，在上世纪90年代就被多位国内外学者所关注[5]。景洪哥纳香是番荔枝科哥纳香属植物，其抗肿瘤活性近年也开始引起学者的关注[6]。笔者对景洪哥纳香的醇提物在体外进行了初步细胞毒活性测试，光学显微镜下观察发现景洪哥纳香醇提物高浓度时可以显著抑制细胞增殖，且发现大量细胞碎片，提示笔者其抗MKN-28增殖作用的机制可能是直接杀死细胞，而不仅仅是诱导细胞凋亡。改良MTT法研究发现其抗肿瘤活性显著，且具有一定的剂量依赖性。提示笔者可以进一步观察其对其它人肿瘤细胞株细胞毒作用如何、以及其细胞毒活性是否存在时间依赖性及其抗肿瘤机制。

笔者通过体外观察两株人肿瘤细胞体外实验，对景洪哥纳香醇提物抗肿瘤活性进行初探，以期为景洪哥纳香的抗肿瘤活性研究提供必要的前期基础。[KH*1D]

参考文献：

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【关键词】 神经干细胞

［摘要］回顾国内外有关阿尔茨海默病（Alzheimer disease， AD）与神经干细胞（neural stem cell， NSC）关系的文献，结合针刺治疗AD的实验研究成果，提出针刺原位诱导AD海马内源性NSC的增殖分化，可能是针刺治疗AD的作用机制，为进一步研究针刺治疗AD提供了新的思路和方向。

［关键词］阿尔茨海默病; 神经干细胞; 针刺疗法

Pondering insitu induction of endogenous neural stem cells in hippocampus of rats with Alzheimer disease by acupuncture

ABSTRACT Analysis of domestic and overseas literature on the relationship between Alzheimer disease (AD) and neural stem cells (NSC) shows that inducing the proliferation and differentiation of hippocampal endogenous NSC insitu by acupuncture is probably the mechanism of acupuncture therapy in treating AD， and that it may further improve the method for the research on AD.

KEY WORDS Alzheimer disease; neural stem cell; acupuncture therapy

阿尔茨海默病（Alzheimer disease， AD）是一种神经退行性疾病。其特征性病理变化为：淀粉样蛋白沉积、神经元纤维缠结、基底前脑和海马区的神经元数目减少，并以海马区受累最为严重，神经元平均减少达47%［1］。目前全世界有2 000～2 500万AD患者，2050年将超过3 000万［2］，我国的AD患者已超过500万。有专家估计，我国用于治疗AD患者的费用，每年至少需50亿，到2050年，预期费用将超过10 000亿［2］。因此，防治AD已成为全社会高度关注的问题。

1AD的神经干细胞修复策略

有研究认为，神经干细胞（neural stem cell， NSC）将为AD的治疗带来革命性的前景［3～6］。早在2001年，在美国国立卫生研究院向美国国会呈递的干细胞科学研究总结性报告中就指出：神经系统疾病的干细胞研究是极少的有证据显示能用细胞替换疗法修复神经丧失功能的研究领域之一［7］。NSC的修复方法主要有两种。一是在实验室里，将未分化的神经细胞培养为适合移植到患者体内的已分化细胞。方法是在种植前就把这些细胞进行培养，使其向所需的已分化神经细胞的方向分化，或者直接把它们种植到体内，由体内的信号来引导它们分化成熟为合适的脑细胞，即外源性移植。但这种方法主要存在免疫排斥、伦理道德以及胚胎来源有限等问题。另一种修复方法是依靠生长激素和其他营养因子（生长因子、激素）以及其他可以帮助细胞存活并生长的信号分子，通过激活患者自己的干细胞和体内的修复机制来修复由疾病或损伤引起的损害，也即内源性原位诱导。这一修复方法已经成为AD等神经变性疾病NSC研究的热点［8～10］，它不仅可成为补偿或替代丢失的海马神经元的新策略，还可以完全避免外源性NSC移植所带来的一系列问题。

2AD的神经干细胞修复研究思路

研究发现，AD病变自身存在内源性NSC的增殖活化。在正常成年个体，内源性NSC主要存在于环绕侧脑室的大脑室下带、纹状体、海马等部位。正常情况下它们处于静止状态，在疾病或某些生长因子的刺激下能被诱导、活化，以替代疾病中缺乏的神经细胞［11～13］。在国外，Jin 等［14，15］研究了AD病变与NSC增殖活化之间的关系。他们以AD患者脑组织作为研究对象，发现在AD患者的海马组织中，与NSC增殖分化相关的蛋白标志物doublecortin、多唾液酸神经元黏附分子、TUC4（TOAD/Ulip/CRMP）和微管相关蛋白（microtubule associated protein， MAP）均呈现高表达；接着他们以转基因小鼠AD模型进行研究，发现在静息NSC集中的两个区域，即环绕侧脑室的大脑室下带和海马齿状回颗粒下层均有NSC的增殖活化。在国内，金国华等［16～18］以切断穹隆海马伞作为AD模型，研究结果表明：穹隆海马伞切断后第7天时，MAP阳性神经元较多，胞体大、突起长，第14天时细胞进一步迁移、成熟；正常组第7天时仅见少量突起短的MAP阳性神经元，第14天时细胞稍增多，突起稍增长；对照组第7天时未见MAP阳性神经元，第14天时仅有少量胞体小、突起短的MAP阳性神经元；而且，穹隆海马伞切割侧的海马提取液可明显促进NSC分化为神经元和胆碱能阳性神经元。这些研究表明：AD病变自身可作为一种刺激原，诱导内源性NSC增殖活化。但AD病变后内源性NSC的增殖活化对AD病变是有利还是有害呢？研究发现，给予NSC增殖活化的特异性抑制剂甲基氧化偶氮甲醇（methylazoxymethanol， MAM）后，不仅NSC的增殖活化受到抑制，同时学习记忆能力亦下降［19，20］。提示：AD病变后内源性NSC的增殖活化是机体实现自身修复的一种潜力。但是为什么AD仍呈进行性发展呢？有研究认为，除了与增殖分化的速度慢于凋亡的速度有关外，还与机体存在抑制NSC增殖分化的因素有关［14，15］。

加强促进NSC增殖分化的因素或解除抑制NSC增殖分化的因素，都将有利于AD患者海马内源性NSC的增殖分化，实现AD的治疗效应。周思朗等［21］从增加神经营养类物质以促进原位诱导内源性NSC增殖分化的角度，采用前脑Meynert基底核注射红藻氨酸形成的AD模型，每天予以侧脑室注射碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor， bFGF），7 d后发现，室管膜下区及海马齿状回代表NSC的溴脱氧尿嘧啶核苷（bromodeoxyuridine， BrdU）阳性细胞明显增加，提示bFGF可促进AD模型大鼠脑内NSC的增殖分化；同时，AD模型大鼠的学习记忆能力亦有所改善。此外，对表皮生长因子（epidermal growth factor， EGF）［22］、脑源性神经营养因子［23，24］、血管内皮生长因子［25］和胰岛素样生长因子1［26］等的研究也获得了类似的结果。一些学者则从抑制NSC增殖分化因素的角度进行研究，结果发现：海马齿状回内骨形态发生蛋白及其受体的高水平表达，是抑制海马NSC增殖分化的关键因素［27～29］。抑制内源性noggin蛋白的表达，可使NSC增殖分化降低，同时学习记忆能力下降［30］；给予侧脑室注射外源性noggin蛋白，可拮抗骨形态发生蛋白4，促进NSC增殖分化，增强学习记忆能力［31，32］。此外，给予EGF和FGF或两种以上物质进行联合注射，亦可获得类似的结果［33］。虽然动物脑内注射实验已取得了很好的疗效，但要在临床推广应用仍存在难以长期坚持的问题。联合注射的疗效可能更好，但究竟如何进行联合，目前尚无明确的答案。

3神经干细胞修复研究的针刺介入

临床研究［34~36］表明：针刺治疗AD主要在于改善认知和学习记忆的能力。在其作用机制的研究方面，已经进行了针刺治疗AD的行为学、神经递质（乙酰胆碱、兴奋性氨基酸等）、血浆一氧化氮、细胞因子、血清β淀粉样蛋白、生长因子、突触可塑性和信号传导［37～45］等多方面的研究，但尚无应用针刺原位诱导内源性NSC进行AD治疗的作用机制研究的相关报道。但针刺原位诱导AD海马内源性NSC具有其自身的优势和极大的可行性。在自身优势方面，针刺疗法的作用原理不是从外部向机体增加物质，而是充分调动机体自身的内在潜力，发挥治疗和调整效应，这样可以避免NSC外源性移植或注射诱导所带来的伦理道德、免疫排斥以及难于长期坚持等问题。其次，有研究发现［46］，外源性给予两种或两种以上的某些物质进行联合诱导，效应会是1＋1＞2，但哪些物质进行联合诱导效应最佳，尚未有明确的结论。目前公认，针刺疗法具有综合性、整体性、双向性等自身调整的特点和优势，可以从多环节、多途径进行调整。它既可能增强NSC增殖活化的因素，也可能解除抑制NSC增殖活化的因素，从而发挥最大的诱导效应。针刺原位诱导除了有自身的优势外，还有极大的可行性。首先是间接依据方面，目前针刺对脊髓损伤、脑梗死和帕金森病后NSC作用的研究已取得部分成果。Cui等［47］制作大鼠脊髓损伤模型后，行督脉电针，1次/d，电针7 d后，检测NSC增殖和分化标记物nestin的表达。结果显示：在督脉电针后第7、14、21和28天，nestin的表达均增加，且增加的nestin阳性细胞数与神经功能改善相平行。李常新等［48］研究表明：电针可通过干预脑内内源性NSC的变化促进脑梗死的恢复。电针治疗不仅可促进室管膜下层、病灶周围及海马NSC的增生，促进急性期新生神经元的增多，还可使病灶周围、迁移流动带处及海马移行细胞及移行的NSC增多，增加移行的新生神经元。我们在已完成的“电针对帕金森小鼠NSC多巴胺神经元突触形态与功能可塑性影响的研究”中发现，针刺可诱导黑质致密部内源性脑源性神经营养因子［49］和NSC标记物nestin的表达，促进NSC的增殖、分化，从而促进突触可塑性的发挥。这些研究结果为针刺原位诱导AD海马NSC的可能性提供了间接的依据。在直接依据方面，我们在已结题的“电针促进老年痴呆大鼠海马神经元突触可塑性的影响及机制”的研究中发现，电针可以诱导老年痴呆大鼠海马内源性神经生长因子、一氧化氮和cfos的表达，从而增强海马残存神经元形态的可塑性，发挥其代偿功能［43］；同时，与学习记忆密切相关的海马胆碱能神经元阳性数目增多，乙酰胆碱转移酶活性增强。结合Calza 等［50］的研究发现，神经生长因子可以诱导海马NSC定向分化为胆碱能神经元，我们认为：针刺疗法极有可能是通过增强海马内源性神经生长因子的表达，促进了海马内源性NSC的增殖活化，并定向分化形成新生的胆碱能神经元。如果能作进一步的深入研究，将会为针刺治疗AD作用机制的研究提供新的思路和方向。

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篇(6)

论文关键词：基因治疗,移植静脉,再狭窄

随着医疗水平的发展，像静脉移植等手术方法治疗包括冠状动脉在内的血管狭窄等疾病给病人生活带来新的希望，但术后通畅率逐年下降又给病人带来新的忧虑。目前对预防移植静脉再狭窄主要手段有放射、药物、物理治疗，虽然有一定成效，但效果还是不佳，随着生物科学技术的发展，人们将希望寄托于基因治疗。下面将对基因治疗中目的基因和载体的选择进展进行综述。

1.目的基因的种类静脉桥再狭窄主要机制就是内皮细胞的损伤；血栓形成；平滑肌细胞的迁移和增殖。这为我们目的基因的选择提供依据。

1.1促进内皮细胞修复的基因。

1.1.1内皮型一氧化氮合酶(eNOS)一氧化氮（NO）是体内重要的生物信使分子和效应分子，它具有抑制vsmc增殖、迁移，抑制血小板聚集等功能。而eNOS是NO合成的关键酶，通过将eNOS基因局部转移，是防止移植血管狭窄的有效手段。王晓明等通过给静脉桥转染带有eNOS基因的复制缺陷型重组腺病毒，再旁路移植到动脉后得出其加速内皮细胞再生、抑制血栓形成，进而抑制内膜增生。

1.1.2血管内皮生长因子(VEGF)VEGF能高效的刺激内皮细胞的增殖，使损伤的内皮尽快得到修复，也可以间接抑制血管平滑肌细胞迁移和增殖。VEGF165是最主要的异构体，是其生物学作用的主要形式，也是目前的基因治疗中主要选用的异构体。有研究表明通过腺病毒介导的VEGF过度表达可以使球囊损伤的动脉内皮细胞再生，抑制血管内膜增殖。

1.1.3肝细胞生长因子(HGF):HGF是一种间质细胞衍生的多功能细胞因子，能刺激血管内皮细胞分裂和增殖,促进血管内皮细胞损伤的修复，但不引起VSMC的增殖。有研究表明转染HGF基因可增强球囊损伤后血管内皮组细胞的功能，有效抑制损伤血管的狭窄。

1.2抗血栓形成的基因。

1.2.1组织因子途径抑制物(TFPI)TFPI是相对稳定的糖蛋白，是广谱的Kunitz类型丝氨酸蛋白酶抑制物，其具有很强的抗凝作用。有研究表明通过腺病毒介导TFPI基因局部转染可以显著抑制PICA术后血栓形成和内膜增厚，主要是通过促进血管平滑肌细胞（VSMC）凋亡而抑制血管的狭窄的。

1.2.2组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)t-PA纤溶酶原激活剂主要物质之一，主要有血管内皮细胞合成。其主要功能就是裂解纤溶酶原肽键，形成具有活性的纤溶酶。Ross报道t-PA减少能使经皮冠状动脉成形术(PTcA)后血管狭窄,可见t-PA在预防血管狭窄中起到比较重要的作用。t-PA不仅能预防血管狭窄，有项研究也表明tPA基因逆转录病毒载体直接注入介入手术后再狭窄动物模型的血管壁可以减轻狭窄面积，甚至能达到30%。

1.3抑制VSMC增殖迁移的基因。

自体移植静脉再狭窄的主要病理特征为内膜显著增厚。增厚内膜主要是由血管平滑肌细胞增殖、迁移等因素形成，其中有很多调节步骤参与当中。这为我们抑制VSMC增殖、迁移提供许多候选基因。单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）是一种能使无活性的核昔类似物轻甲基无环鸟苷转化为磷酸化的细胞毒性形式，诱导DNA链合成中止引起细胞死亡。实验研究表明HSV-tk基因能抑制新生内膜形成、降低内膜面积与中膜面积的比值(I：M)。FAS是一种凋亡受体，在VSMC中表达较多，当FAS配体在血管壁上表达也可以降低新生内膜的形成。抗细胞迁移金属基质蛋白酶(MMPs)基因在VSMC的迁移中有十分重要的作用,组织型金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1)及其同家族成员都有显著减低I:M比例.

1.4联合基因治疗

由于预防移植静脉狭窄干预靶点太多,而谁是关键基因尚未确定,又加上单一靶点效果并不理想,于是有人联合多个基因进行干预,证明比单一基因干预更有效。Gunn等用C-myb的反义核酸得出能抑制猪经皮冠状动脉成形术后的内膜增生.VanBelle等在兔股动脉上给予VEGF165质粒可以加速内皮化,减少附壁血栓和新生内膜形成。张铁民等实验显示,反义寡核苷酸与VEGF联合应用较两者单用更能显著预防再狭窄。

2.载体的种类为了获得一个好的临床治疗效果，载体的选择是重要的一步。载体就是将目的基因导入特殊部位的工具，通常分为病毒载体和非病毒载体，它们各有自己的优缺点。

2.1病毒载体的种类

2.1.1腺病毒载体腺病毒是无包膜的线性双链DNA病毒，目前的腺病毒载体大多以5型（Ad5）、2型（Ad2）为基础。腺病毒主要优点有转染细胞广泛、携带的DNA量大、感染效率高、重组病毒滴度高、不整合到宿主细胞、理化性质稳定等。以腺病毒介导的基因治疗预防血管狭窄的研究层出不穷。体内转基因表达时间短暂、病毒基因表达的产物引起的毒性反应限制腺病毒这个载体的应用。正因如此，对腺病毒载体的改进正在进行，如经RGD-4C整合素靶向多肽改良后的腺病毒在静脉桥中有更好的转染能力

2.1.2腺相关病毒载体（rAAV）rAAV源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一。

通用的AAV载体都是基于血清型2，即AAV2。因为rAAV感染效率低、制备成本高且只能包装小于4.7kb的基因序列而在基因治疗中受到限制。

2.1.3慢病毒载体慢病毒载体（LVs）是在HIV-1病毒基础上改造而成的病毒载体系统，它能高效的将目的基因导入动物和人的原代细胞或细胞系。LVs具有免疫原性低、整合到细胞上长期表达、可感染非分裂期与分裂期细胞等优点.已有研究表明慢病毒载体应用于球囊损伤致血管狭窄研究的可行性。但慢病毒仍具有潜在的产生复制型慢病毒（RCL）和致癌的风险，相关的研究还是有待加强。

2.2非病毒载体非病毒载体是通过哺乳细胞摄取和细胞间转运大分子物质的机制来把目的基因转入靶器官。虽然非病毒载体具有安全、易得、无免疫源性等优点，但是他们基本上转染效率不高，因此早期在基因治疗研究中没有太高的地位。随着技术的进步，非病毒载体在基因治疗载体选择上占有一定份额，尤其表现在纳米粒子、超声微泡载体上。

2.2.1超声微泡载体：它的作用原理是通过超声的物理效应使细胞膜上产生可逆的小孔，借助此孔外源性物质进入细胞内。Taniyama等通过超声微泡载体将p53的cDNA转入球囊损伤大鼠颈动脉，得出血管内膜和中膜面积的比值显著降低。虽然超声微泡靶向释放技术的靶向性及无创性的优点已达到大部分实验的认可，但其转染效率不高仍是需要大力研究的。

2.2.2纳米粒子：它是现在研究比较热门一种非病毒载体，主要是可以使被包裹的目的基因免受水解酶的降解，将目的基因运载到血管平滑肌上，达到治疗疾病的目的。胡新华等通过纳米粒子介导的反义雷帕霉素靶蛋白(mTOR)基因抑制移植静脉内膜增生得出纳米粒子在血管狭窄治疗中是可行的。现在用的纳米粒子主要是PLGA，它有很好的组织相容性，产物没有任何毒性。

3.总结和展望

这些年来尽管科研及医务工作者在移植静脉获取技术、药物防治、应用血管外支架和放射治疗等方面做了大量的工作并在预防移植静脉再狭窄上取得一定成效，但是总体效果还是不理想。移植后的静脉因为内皮细胞损伤、炎性细胞浸润、平滑肌细胞迁移增殖、细胞外基质增加等一系列病理改变导致移植静脉再狭窄。随着分子生物学技术的发展，安全、高效的载体出现、多基因联合等综合治疗必将能有效预防血管再狭窄。

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1 材料和方法

1.1 试剂

ACC高转移株ACCM、低转移株ACC2由四川大学口腔疾病研究国家重点实验室提供。Trizol试剂盒（Life Technologies公司，美国），逆转录试剂盒及实时荧光定量聚合酶链反应试剂盒（TaKaRa公司，日本），MMP9抗体、山羊抗兔二抗、辣根过氧化物酶复合物及显色剂DAB抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司），表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）抗体（Bioworld Technology公司，美国），磷酸化表皮生长因子受体（phospho-rylation epidermal growth factor receptor，P-EGFR）、磷酸化细胞外信号调节激酶（phosphorylation extra-cellular signal-regulated kinase，P-ERK）、KGF抗体（Abcam公司，美国）。过氧化物酶标记的二抗及增强化学发光底物（Millipore公司，美国）。

1.2 细胞培养

ACC细胞培养：在RPMI 1640、10%小牛血清、100 U·mL-1青霉素及100 μg·mL-1链霉素培养基中，于37 ℃、5%CO2培养箱中孵育，细胞传代采用0.25%胰蛋白酶消化细胞。细胞生长至70%～80%用于后续实验。

1.3 实验分组

取对数期生长的ACC2接种于培养面积为25 cm2的细胞培养瓶中，设定压力强度为103.74 kPa，根据加压时间不同将实验组分为3 h组、6 h组、12 h组、24 h组。另外将加压培养的ACC2设置为阴性对照组，未加压培养的ACCM设置为阳性对照组。

1.4 免疫组织化学法半定量检测EGFR的表达

将密度为5×104个·mL-1的细胞悬液滴于爬片中央，待细胞贴壁后，在孔板内追加培养基，孵育过夜，于103.74 kPa加压3、6、12、24 h后，弃去细胞培养基，4%多聚甲醛固定15 min。所有的细胞爬片均按免疫ABC法进行检测。3%过氧化氢液37 ℃孵育20 min阻断内源性过氧化物酶；羊血清37 ℃封闭30 min；滴加EGFR抗体4 ℃过夜，次日37 ℃复温1 h；二抗37 ℃孵育30 min；辣根过氧化物酶复合物37 ℃ 30 min，DAB显示1 min。设立空白对照：兔血清代替一抗；阴性对照：PBS代替一抗。显微镜下细胞膜及细胞浆内出现棕色颗粒即为EGFR表达阳性。

1.5 逆转录聚合酶链反应（reverse transcriptase poly-merase chain reaction，RT-PCR）法检测MMP9和EGFR mRNA的表达取各组细胞，以Trizol试剂盒方法提取总RNA，取等量RNA进行逆转录反应，合成cDNA，经Taq-DNA聚合酶作用扩增目标基因MMP9、EGFR、GAPDH。以GAPDH为内参，分析MMP9和EGFR基因的mRNA水平。以未加压组基因的表达量为基线，分析各处理组表达量的改变。MMP9引物序列：5’TCCAGTAGACAATCCTTGCAATGTG3’（正义链），5’CTC-CGTGATTCGAGAACTTCCAATA3’（反义链）；EGFR引物序列：5’GAGTAACAAGCTCACGCAG-TTG3’（正义链），5’GAGGAC ATAACCAGCCA-CCTC3’（反义链）；GAPDH引物序列：5’CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC3’（正义链），5’GTA-GAGGCAGGGATGATGTTCT3’（反义链）。

1.6 Western blot法检测相关蛋白表达

取对数期生长的细胞，以PBS清洗，加入细胞裂解混合液后，将细胞刮下，14 000 r·min-1离心15 min，取上清并[专业提供写作论文和论文写作服务，欢迎您的光临dylw.net]行蛋白含量测定。加入等体积5×SDS-PAGE上样缓冲液，置沸水浴中加热10 min。样本在10% SDS-PAGE凝胶中电泳，电压100 V。电泳完成后湿转或半干PVDF膜上，再将此膜于4 ℃封闭过夜。次日按Western blot试剂盒说明书，利用抗人MMP9、EGFR、P-EGFR、KGF、P-ERK单抗进行抗原抗体结合反应和化学发光实验。

2 结果

2.1 加压环境对细胞内EGFR表达的影响

免疫组织化学检测结果表明：阴性对照组ACC2低表达EGFR，随着加压时间延长，实验组EGFR表达逐渐增加，整体呈时间正相关性，加压12 h后达到最大，与阳性对照组ACCM的表达接近（图1）。

Western blot检测结果表明：1）与阴性对照组相比，实验组EGFR的表达量在加压3 h后达到峰值，超过了阳性对照组中EGFR蛋白表达量，但是其蛋白表达量并未随着加压时间延长而逐步增加，在加压24 h后降至与阴性对照组相似水平。尽管EGFR的表达量未体现出明显的时间相关性，但在加压后，总蛋白的表达量仍有明显的上调。2）实验组P-EGFR的表达量呈时间正相关性，随着加压时间的延长，P-EGFR蛋白表达量逐渐增长，并在加压24 h后达到峰值，而阳性对照组及阴性对照组中P-EGFR均为低表达（图2）。

2.2 加压环境对MMP9和EGFR mRNA表达的影响

RT-PCR法检测结果表明：MMP-9和EGFR mRNA的表达量在加压6 h开始上 调，在加压24 h达到最大，表达量整体表现出时间正相关性。MMP-9加压24 h后其表达量是阴性对照组的3.8倍，EGFR加压24 h其表达量是阴性对照组的4.5倍（图3）。

2.3 压力刺激对转移黏附相关蛋白的影响

Western blot检测结果表明：实验组随着加压时间的延长，MMP9、KGF、P-ERK蛋白的表达量均逐渐增加。MMP9及P-ERK的表达量在加压6 h后明显增加，加压24 h后略有降低；KGF的表达量与时间呈正相关，蛋白表达量在加压24 h后达到最大。阴性对照组的MMP9、KGF、P-ERK均低表达。

3 讨论

为了验证肿瘤微环境能与各种基因相互作用，本研究采用免疫组织化学技术半定量检测不同加压时间对EGFR表达的影响，结果显示ACC2细胞在间质液压升高的情况下上调EGFR表达量。为了更准确地证明间质液压的升高可以影响EGFR蛋白水平的表达，本研究还采用Western blot方法检测了EGFR及P-EGFR的表达情况，结果也证实了肿瘤微环境中间质液压与ACC2中蛋白表达改变的相关性。

MMP9与细胞侵袭迁移能力相关，且ACC细胞的侵袭性与加压时间呈正相关性[7]。本实验中检测了MMP9的mRNA及蛋白表达量，RT-PCR结果显示IFP的升高可从mRNA水平上调MMP9基因的表达，从而改变细胞的生物学行为，进一步证实了肿瘤微环境在肿瘤发生发展中的重要作用；然而蛋白水平的检测结果却是在加压环境中MMP9的蛋白表达量并未随时间延长而逐步增加，仅在加压6 h及12 h后出现了表达高峰。笔者推测，在ACC中可能还存在其他的与侵袭转移相关的分子。研究认为：P-ERK的上调与ACC肺转移存在密切关系[专业提供写作论文和论文写作服务，欢迎您的光临dylw.net]，KGF是与腺样囊性癌密切相关的黏附相关分子，加之肿瘤微环境中IFP的升高也为肿瘤细胞转移提供了有利环境[4，8-9]。在本实验中笔者检测了加压环境中P-ERK及KGF在ACC中的表达情况。Western blot结果在一定程度上证实了这两种蛋白的表达量随着加压时间的延长而逐步增加。这就为加压环境中腺样囊性癌侵袭转移能力增加提供了分子基础。同时蛋白水平的检测也证实了EGFR及P-EGFR的表达量随着环境的改变而改变。这一结果表明肿瘤微环境可与肿瘤细胞相互作用，改变细胞的生物学行为。随着IFP的升高，细胞内与恶性表型相关的基因及蛋白表达量增加，为ACC2侵袭转移提供了分子基础。

IFP的升高与调控血管生成的基因相关，降低其表达或者改善间质流体动力学可早期降低IFP，从而利于常规放化疗的进行[4]。血管内皮生长因子（vas-cular endothelial growth factor，VEGF）、碳酸酐酶Ⅸ（carbonic anhydrase Ⅸ，CAⅨ）、丙酮酸脱氢酶激酶1等基因产物可改变血管的渗透性，降低间质液压，改善细胞外酸化和缺氧，从而克服肿瘤微环境成为治疗屏障这一问题[10]。趋化因子受体CXCR4与腺样囊性癌的组织学类型及转移潜能呈正相关性。在高压环境下黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）以及Src的激活有利于直肠癌细胞的黏附。那么IFP的升高会影响ACC细胞的黏附能力吗？能否解释ACC的极易复发、早期转移以及神经侵袭性的生物学行为呢？因此在今后的实验中，将继续检测与血管相关的分子（如血小板-内皮细胞黏附分子、VEGF-A、VEGF-C及组织纤维蛋白溶酶原激活剂以及Src等）在加压环境中表达量是否改变，进一步建立体内模型；并且，利用VEGF抑制剂、CAⅨ以及丙酮酸脱氢酶激酶1的基因产物来改善肿瘤微环境中升高的间质液压，观察ACC的生物学行为以及上述指标的表达情况，为肿瘤治疗提供理论依据。

综上所述，本实验表明，肿瘤微环境中间质液压的升高可从mRNA及蛋白水平两方面影响MMP9、KGF、P-ERK的表达，从而调控细胞的增殖、黏附、迁移和侵袭能力。

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