基因工程疫苗精品(七篇)

序论：写作是一种深度的自我表达。它要求我们深入探索自己的思想和情感，挖掘那些隐藏在内心深处的真相，好投稿为您带来了七篇基因工程疫苗范文，愿它们成为您写作过程中的灵感催化剂，助力您的创作。

篇(1)

关键词：植物疫苗；基因工程；表达系统；安全性

1 植物疫苗的免疫原理

植物疫苗可诱导粘膜免疫反应，小肠淋巴组织的粘膜上有一种特殊的细胞叫做膜细胞（M 细胞）。粘膜免疫应答就是由M 细胞识别抗原开始的。M细胞识别抗原并将其传递给巨噬细胞，巨噬细胞和其它抗原呈递细胞，再将抗原展示给辅T细胞，辅T细胞识别外源蛋白质片段后就会刺激B细胞制造和释放能中和抗原的抗体，当疾病因子出现时，记忆辅T细胞刺激胞毒T 细胞攻击受感染的细胞，同时它迅速刺激记忆B 细胞分泌中和抗体消灭入侵的病原体。总的来说，转基因植物疫苗可以诱导相应的血清型的IgA 和IgG 反应。

2 植物疫苗的特点

2.1 安全性高

植物是人类食物来源之一，除个别人群对某些特定的植物过敏外，其安全性高。用动物细胞生产疫苗，可能有动物病毒的污染，对人类存在潜在危害。而植物病毒不会感染人类，比较安全，同时也可避免微生物生产疫苗带来的有害产物。

2.2 成本低

植物种植系统简单易行，植物细胞培养条件简单，便于进行遗传操作，可通过大面积栽培获得廉价的疫苗，且不需要技术、设备和种植条件等巨大投资。农作物可以当地生产，还易于储藏和运输，而且经过长期种植，植物栽培、收获、贮藏、加工程序已经形成工业化。与植物生物反应器相比，原核生物反应器与动物生物反应器生产时需要昂贵的技术设备、大量的人力物力。

2.3 植物具有完整的真核表达系统

具有与动物相同的真核加工修饰系统。可以对重组蛋白进行糖基化、磷酸化、酰胺化、亚基正确装配等。微生物系统不能对真核生物蛋白进行正确的翻译后加工。

2.4 转基因植物中的外源基因可重组

通过植物杂交的方法进行基因重组，进而在植物体内积累多种病原体的抗原基因，生产出方便高效的多联疫苗。

3 植物基因工程疫苗外源基因的表达系统

3.1 瞬时表达系统

主要采用植物病毒作为载体，而外源基因插入到病毒基因组中，通过病毒感染植株，从而将外源基因导入植物细胞内，采用这种转化方式，外源基因并不整合至植物基因组中，只是利用寄主细胞在细胞质中进行复制，以高拷贝的形式游离于植物中，并进行高效的表达，因此可在短时间内在植物细胞内积累大量的外源蛋白。采用农杆菌介导的转化，外源基因蛋白的产量一般要低于细胞内可溶性蛋白总量的1%；而采用这种瞬时表达系统,外源基因蛋白总量会远大于1%。

3.2 稳定整合系统

3.2.1 土壤农杆菌介导的遗传转化。目前根癌农杆菌主要用于双子叶植物的遗传转化，其转化植物的机制已从分子水平上基本得到解释。而发根农杆菌，由于对Ri 质粒了解得还不充分，所以对这种转化系统的研究主要集中在以生产次生代谢产物为目的的根组织培养和根的发育。采用农杆菌介导的植物转化最常采用共培养法，即使用农杆菌菌液与叶盘、愈伤组织、悬浮培养细胞、茎段、下胚轴段、子叶切片等部分进行共培养，从而达到转化的目的。

3.2.2 外源DNA 直接导入法。主要包括基因枪法、电激发、PEG诱导法、激光穿孔法、脂质体法、超声波法，其中最常用的是基因枪法。它是将带有外源基因的质粒用亚精胺包裹为直径1μm 左右的金弹或钨弹，再用高压氦气、火药爆炸力、高压放电气体作为动力加速子弹，使它们穿过植物细胞壁和细胞膜，将外源基因带入具有再生能力的植物组织，这样可以在很大程度上缩短再生的时间，从而避免体细胞变异的发生。

4 以植物为载体的免疫技术

4.1 植物疫苗免疫原性和免疫保护作用

由于植物疫苗一般是通过食用来被人体利用。所以如何避免消化酶的影响来保护抗原就是一个重要的研究课题。目前，避免消化酶的影响来保护抗原可分为2类方法：①用沙门氏菌和弧状霍乱杆菌作为载体；②用保护性的包被对抗原进行包装。

用减毒的菌株可以把抗原引向粘膜的表面，有利于粘膜免疫系统摄取所表达的抗原。但是基于减毒菌株的方法具有潜在安全缺陷，而后者可通过生物降解的多聚物、脂质体、蛋白质体或者表达抗原的转基因植物来实现。许多研究表明，植物材料可潜在地保护所选定的抗原。特别在种子中，植物可为亚单位疫苗提供一个富含蛋白酶抑制物的糖类聚合物基质环境。其它的抗原包装方法需要烦琐的处理步骤；而通过植物种子来进行生物包装不需要任何额外的代价，就可以为这些抗原提供保护。在有关转基因马铃薯的研究中，从轮状病毒和产肠毒素大肠杆菌中所选的抗原分别与霍乱毒素的B和A2亚单位融合，抗原的免疫反应显示出对Th1的偏爱性，并可诱导白细胞介素2和干扰素γ，CD4 + 水平也相应增加。Th1的偏爱性很可能是抗原或者载体的选择结果。在佐剂的帮助下，亚单位疫苗的释放能增加免疫反应量。霍乱毒素和大肠杆菌的热不稳定毒素，它们与抗原共表达，有利于诱导保护性的免疫产生，改变口服免疫低效率递呈。另外，有人证实了转基因植物疫苗的粘膜传输中所诱发的免疫应答所具有的黏膜佐剂的特征，这给口服免疫可不需佐剂提供了依据，同时也提高了其安全性。

在以植物疫苗的口服免疫研究中，所候选的亚单位疫苗也具有较好的保护作用。马铃薯块茎或谷物种子中表达的热不稳定毒素的B 亚基和马铃薯中表达的霍乱毒素B 亚基用于小鼠口服免疫，可以保护老鼠免受痢疾的感染。另外，口服免疫由谷物种子表达的传播性肠炎病毒的S2糖蛋白，对乳猪能够起到很好的保护作用。目前，通过植物递送系统来生产B 型肝炎的疫苗也逐渐成熟。

4.2 提高抗原在植物中的表达水平

利用植物进行疫苗开发，首要的问题是，植物能否表达相关的蛋白？目前为止，许多亚单位候选抗原在转基因植物中成功表达，这些抗原主要包括感染人类、家畜、野生动物的细菌和病毒抗原。表达水平很大程度上取决于表达的蛋白和用于表达的植物种类，同时，构建的表达系统也影响抗原的表达水平，比如用于表达的细胞器基因组(核和质粒)、启动子的强度和组织专一性、非翻译前导序列和信号序列的选择和表达蛋白的靶细胞器的定位等均对表达产生影响。一般而言，利用上述策略可以实现抗原高水平表达。然而，很难对表达系统进行比较，因为特定抗原对植物表达系统的选择很重要，在不同的系统中其表达效果是不一样的。近来，研究人员利用内质网滞留信号可提高外源基因的表达量，Mason等利用一个核表达系统，把蛋白定位于内质网滞留信号之后，热不稳定毒素B亚单位在马玲薯块茎中表达量可达总可溶性蛋白质的0.2% ；在谷物种子中的表达量约占总可溶蛋白的4%或12% ，这些都依赖于所用的调节序列。另外，霍乱毒素（B）亚单位在利用内质网滞留信号时在烟草叶片中的表达量约占总可溶蛋白的4%。膜蛋白比可溶性蛋白更难于在转基因植物中表达，大量研究表明，膜蛋白在植物中的表达量远不及可溶性蛋白，这就需要优化表达系统以提高表达水平。

目前，转基因马玲薯表达B型肝炎的表面抗原水平已由马玲薯大约1mg/g增加到马玲薯大约16mg/g抗原，这样可以大大减少口服剂量。目前许多研究表明，所欲表达的抗原在植物中能够表达并装配成四级结构。糖基化修饰的蛋白也可在植物中进行糖基化，尽管糖基化模式很可能存在着差别。在植物系统中表达的热不稳定蛋白毒素的B亚单位和霍乱毒素的B亚单位，均有GM1受体结合活性，B型肝炎表面抗原和诺沃克病毒衣壳蛋白可形成类病毒颗粒，类病毒颗粒的形成，可认为有利于诱导免疫反应。

5 植物基因工程疫苗研究进展

5.1 反转录病毒载体

反转录病毒作为载体是在进行动物基因工程中发现的，许多研究人员认为它同样适于植物基因工程，但目前研究的不多。

5.2 单链RNA植物病毒

单链RNA 植物病毒，即病毒RNA可直接作为mRNA的植物病毒，主要包括苜蓿花叶病毒(ALMV)、豇豆花叶病毒(CPMV)、雀麦花叶病毒(BMV)、烟草花叶病毒(TMV)等。它们作为外源基因载体主要通过以下步骤感染植物：病毒RNA 首先反转录为一条单链cDNA，在DNA聚合酶作用下形成双链DNA，将其克隆入细菌质粒中，将外源基因插入质粒的cDNA中，最后通过体外转录，用带有外源基因的RNA病毒感染植物，将其转入植物细胞。

5.3单链DNA植物病毒载体

在单链DNA 植物病毒载体中，研究最多的是Geminiviruses(简称GeNV) ，又叫做双粒病毒或双联体病毒。它一般含有2个成对并存的病毒颗粒，大小约为18～20nm，遗传物质是单链DNA ,每2个颗粒中包含1～2个、2. 5～3.0 kb的环状DNA分子。该病毒寄主广泛，单子叶植物和双子叶植物均可被感染，但感染部位仅限于植物的维管组织，且其传播媒介主要是昆虫，不能通过机械接种。

5.4 双链DNA植物病毒载体

双链DNA植物病毒载体中最典型的是花椰菜花叶病毒，它的基因组长约8kb，主要感染花椰菜、油菜、拟南芥等，主要寄主是芸苔属植物，目前尚未发现可感染豆科和单子叶植物。

6 植物疫苗的安全性

6.1 对环境的影响

由于在植物疫苗中包含了病原体的DN段，因而花粉和种子的散播造成的基因逃逸可能给人类带来新的病原、毒素、过敏原等，因此对可能引起的基因渐渗现象必须做出充分的安全性评价,并规范植物疫苗的利用和管理，同时寻求技术方法。如可恢复阻塞(RBF)技术，它能使自然界中因渐渗而携带RBF 的杂种或近缘系植物死亡或不育或利用叶绿体转化植物疫苗或培育植物疫苗的雄性不育系，这样就可避免花粉传播而带来的潜在威胁，转基因植物疫苗有着传统疫苗无法比拟的优越性，已经成为一个研究热点了。未来的研究应着眼于生产出作为医药商品的安全、可靠、有效的植物疫苗。转基因植物疫苗应用最大的限制就是表达量低。现在的研究表明：可以通过叶绿体转化、植物育种和利用食品加工技术来提高表达水平，而且研究还指出，运用携带蛋白和辅助蛋白可以增加抗原被免疫系统识别的能力。这些研究都使我们越来越接近生产出廉价“安全口服的商品植物疫苗”，这样的疫苗将可以帮助人们预防疾病的传播。

6.2对人类和动物的影响

抗生素抗性基因是筛选转基因植物常用的标记基因。长期食用这类转基因疫苗是否会对人体或动物造成抗生素医疗无效。转基因植物中的新基因会不会传递给人畜肠道的正常微生物，引起菌群和数量的变化或插入并表达，从而危害人畜健康？这些问题目前都无法解答，仍需大量学者继续研究论证。

7 展望

利用植物来表达和递送疫苗技术的发展给免疫研究注入了新的内容。以往的研究中,在植物中表达了包括过滤性病毒、细菌、肠道和非肠道的病原体等各种不同的抗原，并做了相应免疫学研究。但植物疫苗面临的最大问题是抗原蛋白在植物细胞表达量不高，低剂量抗原蛋白往往不能激发足够的免疫反应，这不能仅靠增加植物组织摄取量得以解决，因为低剂量的重复免疫可能会导致机体的免疫耐受，导致机体对此抗原免疫反应保持“低调”，即使以后增加抗原蛋白的剂量也不能改变。另外，机体每天对植物组织的摄取量是一定的，不可能无限增加。因此，未来研究的重点之一是提高植物疫苗中抗原蛋白的表达量。随着生物技术的发展和植物基因工程研究的深入，基于植物的疫苗递送系统将更具吸引力，并呈现出广阔的应用前景。

参考文献

1 余祖华，王红宁.用植物生物反应器研制基因工程疫苗的进展[J].生

物技术，2004（8）

篇(2)

【关键词】 药学院；基因工程药物；公选课；意义；存在问题；改进对策

基因工程是当前自然科学中最引人注目的前沿学科之一，自诞生以来以其旺盛的生命力获得了迅猛的发展，不仅给生命科学带来了许多令世人瞩目的成绩，并且在化学、药学等诸多领域均有着引人注目的发展前景。自1982年美国Lilly公司推出重组胰岛素以来，基因工程药物的出现与发展不仅有效控制了多种威胁人类健康的重大疾病，而且极大扩展了疑难病症的研究范围，引起了现代医药行业的重大变革。因此，笔者于2007年起在学校开设《基因工程药物》公选课，并对其教学内容和方法进行了一些思考和尝试。

一、开设《基因工程药物》公选课的意义

1、基因工程在药学领域的应用必将在21世纪成为自然科学发展的核心之一

早在上个世纪日本学者伊东光就断言：“21世纪是生命科学的世纪。”今天，这一预言已成为现实，人类生存与发展所面临的许多重大问题都或多或少的与生命科学息息相关，这一点从近几十年的许多诺贝尔奖得主的科研成果中也可以看出。而在生命科学中，基因工程是它的基础核心学科。所以，未来的自然科学的发展必然需要与基因工程相结合。

从科学的发展来看，现代学科的发展已不再是传统的单一学科的发展，而是通过多学科的交叉渗透研究促进所本学科的进步，过去单一学科研究的问题现在很多已经变成多学科共同关注的问题。由于基因工程对理工科各学科相关专业均可提供更广阔的研究思路和重要的技术支持，因此基因工程现在已经成为各专业发展中重要的研究方法和手段。大学教育也应该适应这一发展趋势，结合基因工程在药学领域中的应用，开设《基因工程药物》公选课能够为理工科的学生打开一扇基因工程的窗户，培养必要的学科交叉研究意识，为他们以后在本专业的发展上提供更广阔的空间。

2、基因工程药物对社会影响巨大，必须引起相关社会科学专业的重视

社会的发展与进步是全面的，不是单一的；社会科学和自然科学同样也不是泾渭分明、互不侵犯，而是在不断的发展中有相互融合的趋势。作为一个自然科学家，必须要具备相当的社会科学常识，否则就有可能成为科学的狂人，社会的罪人，正如自然科学的发展促进了工业革命之后的社会进步，可是也造成了资源的浪费和环境的污染。同样，作为一个社会科学研究者或从业人员必须要具备自然科学的常识，能够在研究或管理中正确使用相关知识，对待相关问题，更好的为社会服务。

今天的时代是信息的时代，社会中充斥着各种各样的信息，如何能够在纷繁复杂的信息中寻找或利用相关资料，就必须了解相关的知识；今天的时代也是科技的时代，各种高科技成果在生活中的广泛使用，使得我们必须在管理中要通晓相关的概念。基因工程药物的发展和进步已经对社会造成了巨大影响，其产业化过程中的产品和概念也在社会中随处可见，它促进了社会的进步，也潜藏着各种安全性和伦理学问题。例如“基因治疗”使得科学家具有“扮演上帝”的可能性，将引起基因争夺战和基因殖民主义等一系列伦理学和法律问题……在未来，随着基因工程药物品种的不断增加，如何能够在为人类造福的同时尽量减少其对社会产生的负面影响，是社会科学必须考虑的问题。所以，社会科学专业本科生作为未来社会的管理者和研究者，有必要对他们进行基因工程药物的启蒙教育，这样才能够在未来让基因工程药物在社会上发挥更大的作用。

3、《基因工程药物》公选课的开设对提高素质教育质量非常重要

由于我国在中等教育中采取了文理分科的方法，大多数高中在高一之后就开始文理分班，这使得本科生各专业之间有着极大的差别，理科生对于文科常识陌生，文科生对于理科知识不了解，这样的培养方式非常不利于学生素质的提高。《基因工程药物》作为前沿性学科对于科学的理论、方法论的传播有着重要的意义，无论是哪个专业的学生，都可以通过这样一门课较为系统的接受自然科学思想体系的训练，可以很大程度的提高学生的创造力和思维的延展性，从而不仅能让理科生拓宽个人的眼界，也能让文科生学习使用理工科的思维方式，对于消除文理之间的鸿沟起到重要作用。同时，在本科生的培养中，我们一贯强调“宽口径、厚基础、全面发展”，只关注与本专业、本学科的成就与发展，只会让学生的发展之路越走越窄，如果我们要培养具有创新精神、实践能力的高素质人才，就不能闭门造车。

从另一方面来说，新世纪的竞争越来越激烈，大学生承受着来自社会、家庭、个人越来越大的压力，在错综复杂的形势面前，多一份知识的了解就会更有利于个人的进步和社会的发展。所以，《基因工程》公选课的开设对大学生素质教育的培养和提高非常重要。

二、《基因工程药物》教学中存在的问题

1、对《基因工程药物》学习意义认识不足

开设《基因工程药物》公选课的目的在于拓宽知识面，提升专业素养，培养创新能力，提高综合素质，但是对于学生而言，往往意识不到学习《基因工程药物》的重要性。

首先，学生选课存在盲目性，导致学习缺乏针对性。通过和学生的交流笔者发现，一些学生选课的目的是出于对基因知识的好奇，而不是针对自身知识结构查漏补缺，提升自身能力，还有一些学生选《基因工程药物》是受别人影响，他们也不知道学这门课有什么用，周围的或同寝室的同学选了自己就选了。这就导致部分学生学习缺乏兴趣，也不知道该怎么学、学什么。其次，学生对于公选课不重视，学习态度不端正，导致缺乏学习的主动性和自觉性。相当一部分学生对《基因工程药物》公选课的学习无所谓，认为这又不是专业课，只是混个学分，即使上课，也没打算好好学，没有一个良好的心态，更没有明确的学习规划，这样的学习效果可想而知。

2、学生来源复杂，程度参差不齐

和专业课不同，公选课的同学来自于不同院系不同专业，成分复杂。对于《基因工程药物》这样一门专业性很强的课程来说，专业的区别只是一个方面，更重要的是不同专业的学生对于课程的需求各有不同，给授课带来一些困难。例如对于理工科相关专业的学生来说，他们的要求可能就要深入一些，相关的概念、理论理解起来也较为容易；但是对于一些文科学生而言，可能更希望获得一些科普性质的知识，太过于专业会让他们产生畏难心理，不利于进一步的学习。如何做到因材施教，是笔者在教学中始终面临的问题。

三、《基因工程药物》教学改进对策

1、端正认识，提高兴趣

由于许多学生选《基因工程药物》缺乏明显的目的性，对上课当然就没有兴趣。所以，第一节课特别重要，不能使用过于专业的语言阐述基因工程药物的相关概念和理论，这样会让学生畏惧。要从学习《基因工程药物》的意义谈起，例如重组生长激素和侏儒症、如何正确对待流感疫苗等生活中、社会中常见的、有趣的案例入手，从科学的发展方向出发，使学生意识到学习这门课无论对现在的专业学习还是对未来的深造、就业都会产生难以估量的好处，不仅要让学生在第一节课中产生对这门课的浓厚兴趣，更要让学生认识到通过学习可以给他们带来实际的价值，从而增加他们学习的主动性和能动性。

当然，仅靠一节课远远不够，要想每一节课都能留住学生的兴趣，就要每一节课都能满足他们的求知欲和好奇心，笔者在每一节课上都以实际发生的案例引入，尽量使用浅显、通俗、易懂的语言讲述相关的概念，重点放在概念和理论的引申上，因为公选课的学生都来自于不同专业，有文有理，不能像本专业的学生一样讲的深入，而是要在广博上下功夫。例如从《逃离克隆岛》片段引入，介绍克隆的相关知识和原理，最后 讨论在伦理学、法 学、社会学等领域对“医学克隆”的认识和争论；结合“甲型H1N1流感”，从基因角度讲述疫苗的研制、生产，说明基因工程药物在实际生活中的巨大用处等。这样做的优点是每一个专业的学生总能从课堂上找到和本专业相关的切入点，减少了距离感，增加了学生的兴趣。

2、重在普及，强调重点

公选课的教学毕竟和专业课在授课对象上有较大差距，所以要有所区别，专业课的教学强调概念准确、原理清晰、深入透彻，要让学生不仅“知其然”，还要“知其所以然”，要花很多时间在各种理论的说明和推导上。而公选课则不然，学生的目的各不相同，不同的需求会导致不同的学习行为，过于专业的讲授可能会让本专业的学生满意，但可能会让公选课的学生觉着索然无味。同时由于很多文科学生缺乏理工科的训练，一些专业的知识会让他们摸不着头脑。因此，很多时候要把《基因工程药物》公选课当做科普课上，做好自然科学的普及工作，给予学生一些课程的基础训练。

同时，对于一些理工科的学生也要满足他们的求知欲，要在一些可能会引起他们兴趣的要点上，用其他专业的方式或语言，如医学、化学、环境工程等，较为深入的讲述相关理论，这样做既能引起他们兴趣，又能让他们更快、更深刻的理解概念。

3、加强交流，尝试讲座式教学

学生是我们服务的对象，了解他们的需求笔者认为是最重要的。所以课前课后，笔者总是早到晚走，在讲台下和学生沟通，了解他们的所思所想和感兴趣的地方，按专业分成小组，指定组长，定期收集学生对授课内容的反馈，对授课过程中的问题第一时间解决，鼓励学生提问题，授课内容也会针对学生的需求做适当调整。例如2008年北京奥运会期间，有学生无意中提出是否有“基因工程兴奋剂”？笔者针对这一问题组织了促红细胞生成素、生长激素等基因工程药物的学习，并启发学生进行基因工程药物的伦理学讨论，激发学生的学习兴趣。

此外，传统的教学方式容易引起学生的反感，让他们觉着上课内容和他们无关，极易造成学生的课堂流失，而讨论式、专题式的教学方式最能够调到学生的学习的主动性和创造性。因此笔者采用讲座式的授课方式，课程内容不依照教材章节，而是按学生需求分成不同内容的讲座，课上加强互动，使学生不是被动的接受知识，而是成为课堂的主人。每一次课的最后都要留出一部分时间，鼓励学生提问、讨论和交流，让他们主动思考，激发他们活跃的思维。例如“基因工程疫苗”一章，在最初两年是以“乙肝疫苗”为例进行学习，但在2009年后就改为“甲型H1N1流感疫苗”，并结合“甲型H1N1流感疫苗”和“乙肝疫苗”两者的对比，使学生正确对待疫苗的使用。

4、利用多媒体手段，加强启发式教学

《基因工程药物》课程的信息量较大，也比较抽象，利用现代的多媒体手段可以形象、细致的展示相关内容，能够让学生得到直接的体验，强低了学习和理解的难度。如播放一些电影、电视节目等，通过讨论让学生说出从基因和自己专业相结合的角度在视频资料中看到了什么，能想到什么，启发学生独立自主的用基因的知识去思考。所以，要多利用、善于利用视频影像资料，制作精良的课件授课。例如，利用“记者探秘我国甲型H1N1流感疫苗生产过程”的视频，使学生对于疫苗的制备流程，以及正确使用等有了直观的、系统的认识；再比如“医学克隆”一章，首先让学生观看《逃离克隆岛》片段，然后利用专业知识对电影中的某些细节进行描述，引出克隆在医学上的应用，使学生能够从较为专业的角度理解“医学克隆”，从而达到教学目的。

总之，开设公选课的目的是希望通过授课为学生打开一扇窗，让他们了解并能够简单使用基因工程相关理论，因此，要在启发学生思维上下功夫，我们甚至可以说，在这门课上学到什么并不十分重要，在学习基因工程药物的过程中想到了什么才是最重要的。

【参考文献】

[1]汪燕芳，何俊民，朱云国.谈“现代生物技术导论”公选课的开设思路[J].高教论坛，2008（1）.

【作者简介】

任雪玲，女，河南郑州人，郑州大学药学院副教授、博士，研究方向：基因工程药物分析.

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[关键词] 传染性支气管炎 疫苗 研究

[中图分类号] S831 [文献标识码] A [文章编号] 1003-1650 （2016）08-0247-01

鸡传染性支气管炎 （IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（IBV）引起，严重危害我国养禽业的一种重要疾病。各年龄阶段鸡均可发病，但雏鸡最为严重，一般以40日龄以内的鸡多发，产蛋期也有发生。IBV较高的基因突变率造成了IBV 复杂的血清型，目前的血清学交叉中和试验表明，全世界IBV已有近30个血清型，并仍有不断上升的趋势，且各血清型或毒株之间交叉保护性较弱，从而给本病的防控带来较大的困难，急需研制新的疫苗有效的预防该病的发生。

1 灭活疫苗

灭活疫苗安全性好，不存在散播病原和毒力返强的问题，但是，由于IB血清型的多样性，单价灭活苗不能阻止IBV变异株引起IB的暴发。王红宁等（1999）对我国IB的流行病学进行调查研究，试制了多价油乳剂灭活疫苗，扩大常规疫苗的保护范围，发现能有效地预防多型IB。灭活疫苗的不足之处是使用剂量大，需要配合佐剂， 制备比较复杂、成本较高等。为有效的防治该病的发生，目前，国内多将弱毒疫苗滴鼻和灭活疫苗注射结合起来使用。

2 IB弱毒疫苗

IB 弱毒疫苗是由抗原性良好的毒株通过鸡胚连续传代致弱后制备的冻干疫苗。目前我国广泛使用M41 血清型的鸡胚适应毒H52和H120两种疫苗。为达到较好的免疫效果，多在早期育雏防控，H120 株疫苗用于雏鸡和其它日龄的鸡，H52用于经 H120 免疫过的大鸡，育成鸡开产时选用 H52 疫苗，能有效刺激机体的免疫系统。但鉴于弱毒疫苗有可能成为其突变的主体和重组变异的供体，同时肾型与支气管炎型的免疫机制还存在着很大的差别，这在很大程度上亦影响着疫苗的免疫保护作用。并且，活疫苗其致弱程度难以掌握，疫苗的运输、贮存和使用等的条件要求较高。秦玉明等（2009）应用耐热冻干保护剂研制成功鸡传染性支气管炎病毒（H52株）耐热冻干活疫苗，临床观察无不良反应，安全有效，且抗原性不变，彻底改变国内兽用生物制品延续了 20多年采用脱脂牛奶制备活疫苗仅-15 ℃保存的历史，达到国外同类产品的技术水平。

3 基因工程疫苗

3.1 亚单位疫苗

亚单位疫苗是指用基因工程方法构建，在高效表达系统中表达出来强毒病原体的某种免疫相关抗原肽链。提取保护性抗原，加入佐剂即制成亚单位疫苗。常用的表达系统为大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和植物表达系统。黄亚东等（2002）构建了含BIV GD6株S1基因的大肠杆菌重组表达载体，并在大肠杆菌中获得表达。又在毕赤酵母中表达了IBV的S1基因，所表达蛋白的分子量小于天然蛋白。戴亚斌等利用Bac-to- Bac杆状病毒表达系统构建的重组杆状病毒，表达了传染性支气管炎病毒的S1基因，其在昆虫细胞中表达的蛋白可以诱导抗体产生中和免疫保护反应。周继勇等（2003）利用根瘤菌将IBV全长S 基因转入马铃薯中表达，提取免疫原免疫鸡，通过3次免疫后，免疫鸡受到完全保护。王红宁等（2003）通过RT-PCR获得IBV S1基因片段，并将其导入玉米表达载体进行了表达。

3.2 核酸疫苗

核酸疫苗由编码能引起保护性免疫反应的病原体抗原的基因片段和载体构建而成，在构建多价疫苗方面具有突出的优势。陈洪岩（1999）、刘思国等（2001）分别将IBV S1基因和N基因构建成真核表达质粒， SPF鸡肌肉注射后，结果目的基因在鸡体内得到了表达，鸡获得了一定的免疫力。Minglong 用含IBV N 蛋白C末端120 aa 的cDNA 片段的重组质粒接种雏鸡，证实了在缺乏S1蛋白时，N 蛋白也可以作为DNA疫苗免疫的目的基因，保护雏鸡抵抗急性感染。

3.3 活病毒载体疫苗

活病毒载体疫苗是用利用分子生物学遗传工程技术将保护性抗原基因整合进载体基因组中，构建成使之表达的重组活载体疫苗。Wang X等（2002）用重组鸡痘病毒表达了IBV的S1基因，免疫鸡受到部分保护。Yu等（2003）用重组鸡痘病毒表达IBV的C末端NL蛋白120个氨基酸进行预防研究，诱导了一些IBV株交叉保护免疫，可以很好的抵制和预防IBV强毒的攻击。孙永科等（2005）将鸡II型干扰素基因和鸡传染性支气管炎病毒S1基因同时插入到鸡痘病毒转移载体中，重组鸡痘病毒疫苗在对鸡体的免疫应答中发挥了一定的作用。Johnson MA 等（2003）利用禽 8 型腺病毒表达 IBV S1 基因，对0日龄和6日龄鸡分别进行口服免疫，35 日龄时用同型或异型强毒株进行攻毒，试验结果显示，对于 IBV 同源和异源毒株在支气管的保护率达到 90%～100%。

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关键词：基因工程；发展现状；发展前景；基因工程利弊

一、基因工程

（一）基因工程的概念及发展

1.概念

基因工程又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。

2.发展

生物学家于20 世纪50 年现了DNA 的双螺旋结构，从微观层面更进一步认识了人类及其他生物遗传的物质载体，这是人类在生物研究方面的一次重大突破。60 年代以后，科学家开始破译生物遗传基因的遗传密码，简单地说，就是将控制生物遗传特征的每一种基因的核苷酸排列顺序弄清楚。在搞清楚某些单个基因的核苷酸排列顺序基础上，进而进行有计划、大规模地对人类、水稻等重要生物体的全部基因图谱进行测序和诠释。

（二）基因工程的发展现状及前景

1.发展现状

（1）基因工程应用于农业方面。运用基因工程方法，把负责特定的基因转入农作物中去，构建转基因植物，有抗病虫害，抗逆，保鲜，高产，高质的优点。

下面列举几个代表性方法。

①增加农作物产品营养价值如：增加种子、块茎蛋白质含量，改变植物蛋白必需氨基酸比例等。

②提高农作物抗逆性能如：抗病虫害、抗旱、抗涝、抗除草剂等性能。

③生物固氮的基因工程。若能把禾谷等非豆科植物转变为能同根瘤菌共生，或具固氮能力，将代替无数个氮肥厂。④增加植物次生代谢产物产率。植物次生代谢产物构成全世界药物原料的 25% ，如治疗疟疾的奎宁、治疗白血病的长春新碱、治疗高血压的东莨菪碱、作为麻醉剂的吗啡等。

⑤运用转基因动物技术，可培育畜牧业新品种。

二、基因工程应用于医药方面

目前，以基因工程药物为主导的基因工程应用产业已成为全球发展最快产业之一，前景广阔。基因工程药物主要包括细胞因子、抗体、疫苗、激素和寡核甘酸药物等。对预防人类肿瘤、心血管疾病、遗传病、糖尿病、包括艾滋病在内的各种传染病、类风湿疾病等有重要作用。我们最为熟悉的干扰素（IFN）就是一类利用基因工程技术研制成的多功能细胞因子，在临床上已用于治疗白血病、乙肝、丙肝、多发性硬化症和类风湿关节炎等多种疾病。 并且应用基因工程研制的艾滋病疫苗已完成中试，并进入临床验证阶段；专门用于治疗肿瘤的“肿瘤基因导弹”也将在不久完成研制，它可有目的地寻找并杀死肿瘤，将使癌症的治愈成为可能。

三、基因工程应用于环保方面

工业发展以及其它人为因素造成的环境污染已远远超出了自然界微生物的净化能力，基因工程技术可提高微生物净化环境的能力。美国利用DNA 重组技术把降解芳烃、萜烃、多环芳烃、脂肪烃的4 种菌体基因链接，转移到某一菌体中构建出可同时降解4 种有机物的“超级细菌”，用之清除石油污染，在数小时内可将水上浮油中的2/3 烃类降解完，而天然菌株需 1 年之久。90 年代后期问世的DNA 改组技术可以创新基因，并赋予表达产物以新的功能，创造出全新的微生物，如可将降解某一污染物的不同细菌的基因通过PCR 技术全部克隆出来，再利用基因重组技术在体外加工重组，最后导入合适的载体，就有可能产生一种或几种具有非凡降解能力的超级菌株，从而大大地提高降解效率。

（一）发展前景

基因工程应用重组DNA 技术培育具有改良性状的粮食作物的工作已初见成效。重组DNA 技术的一个显著特点是，它注往可以使一个生物获得与之固有性状完全无关的新功能，从而引起生物技术学发生革命性的变革，使人们可以在大量扩增的细胞中生产哺乳动物的蛋白质，其意义无疑是相当重大的。将控制这些药物合成的目的基因克隆出来，转移到大肠杆菌或其它生物体内进行有效的表达，于是就可以方便地提取到大量的有用药物。目前在这个领域中已经取得了许多成功的事例，其中最突出的要数重组胰岛素的生产。 重组DNA 技术还有力地促进了医学科学研究的发展。它的影响所及有疾病的临床诊断、遗传病的基因治疗、新型疫苗的研制以及癌症和艾滋病的研究等诸多科学，并且均已取得了相当的成就。

（二）基因工程的利与弊

1.基因工程的利

遗传疾病乃是由于父或母带有错误的基因。基因筛检法可以快速诊断基因密码的错误；基因治疗法则是用基因工程技术来治疗这类疾病。产前基因筛检可以诊断胎儿是否带有遗传疾病，这种筛检法甚至可以诊断试管内受精的胚胎，早至只有两天大，尚在八个细胞阶段的试管胚胎。做法是将其中之一个细胞取出，抽取DNA，侦测其基因是否正常，再决定是否把此胚胎植入母亲的子宫发育。胎儿性别同时也可测知。 基因筛检并不改变人的遗传组成，但基因治疗则会。目前全世界正重视发展永续性农业，希望农业除了具有经济效益，还要生生不息，不破坏生态环境。基因工程正可帮忙解决这类问题。基因工程可以改良农粮作物的营养成分或增强抗病抗虫特性。可以增加畜禽类的生长速率、牛羊的泌乳量、改良肉质及脂肪含量等。

2.基因工程的弊

广泛的基因筛检将会引起一连串的社会问题。虽然基因筛检可帮助医生更早期更有效地治疗病人，但可能妨碍他的未来生活就业。基因工程会产生“杀虫剂”的作物，也可能对大环境有害，它们或许会杀死不可预期的益虫，影响昆虫生态的平衡。转基因食品不同于相同生物来源之传统食品，遗传性状的改变，将可能影响细胞内之蛋白质组成，进而造成成份浓度变化或新的代谢物生成，其结果可能导致有毒物质产生或引起人的过敏症状，甚至有人怀疑基因会在人体内发生转移，造成难以想象的后果。转基因食品潜在危害包括：食物内所产生的新毒素和过敏原；不自然食物所引起其它损害健康的影响；应用在农作物上的化学药品增加水和食物的污染；抗除草剂的杂草会产生；疾病的散播跨越物种障碍；农作物的生物多样化的损失；生态平衡的干扰。

四、结束语

随着社会科技的进步，基因工程的发展将成为必然。尽管它会给我们带来一些危害但是仍然为我们带来了很多好处。不仅为我们提供了新的能源而且促进了各国的经济的发展，所以在我们发展基因工程的同时应该尽力避免一些危害，而让有利的方面尽可能应用。

参考文献：

[1]陈宏.2004.基因工程原理与应用.北京：中国农业 出版社

[2]胡银岗.2006.植物基因工程.杨凌.西北农林科技大学出版社

[3]刘祥林.聂刘旺.2005.基因工程.北京：科学出版社

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1.了解活疫苗和死疫苗的特点

死疫苗是选用免疫原性好的细菌、病毒、立克次氏体等，经人工培养，再用物理或化学方法将其杀灭制成的。此种疫苗失去繁殖能力，但保留免疫原性。死疫苗进入机体后不能生长繁殖，对机体刺激时间短，要获得持久免疫力需多次重复接种。死疫苗按佐剂不同分为3种：一是蜂胶佐剂灭活疫苗。蜂胶可增强免疫的效果，减轻注苗反应。这类灭活疫苗作用时间比较快，但制苗工艺要求高，需高浓缩抗原配制。二是油佐剂灭活疫苗。这类疫苗为灭活疫苗，以白油为佐剂乳化而成，大多数病毒性灭活疫苗采用这种方式。油佐剂疫苗注入机体后，疫苗中的抗原物质缓慢释放，从而延长疫苗的作用时间。三是铝胶佐剂疫苗。以铝胶按一定比例混合而成，大多数细菌性灭活疫苗采用这种方式，疫苗作用时间比油佐剂疫苗快。死疫苗一般在2-8℃避光保存，不宜冻结，有效期一年。使用前需充分摇匀，用量较大，对猪体的副作用也大，一般要少量多次接种。其优点是容易保存，安全，毒力不能返强，不存在散毒和造成新疫源的危险，容易制成联苗。

活疫苗可通过从带菌者中分离毒力弱的菌株获得，也可通过人工培养，使微生物产生变异，从毒力弱的菌株中获得。接种后在体内有生长繁殖能力，接近于自然感染，可激发机体对病原的持久免疫力。活疫苗用量较小，免疫持续时间较长，免疫效果优于死疫苗。大多数的活疫苗都采用冷冻真空干燥的方式冻干保存，以延长疫苗的保存时间，保持疫苗的效价。病毒性冻干疫苗常在- 15℃以下保存，保存期一般为两年。细菌性冻干疫苗在- 15cc保存时保存期一般为两年，2-8℃保存时保存期为9个月。当活疫苗接种到猪体后，能在一定部位繁殖一段时期，但由于毒力弱，不会引发疾病，而能使猪体产生免疫力。活疫苗用量少，副作用小，只需接种一次，但不易保存。

2.区分不同情况选用活疫苗或死疫苗

疫苗从来源上又分为免费疫苗和自费疫苗。免费疫苗是指政府免费向养猪户提供，养猪户应当依照政府规定的强制免疫项目受种的疫苗；自费疫苗是指由养猪户自费并且自愿受种的其他疫苗。

免费疫苗有3种：一是口蹄疫病毒疫苗。目前我县选用的口蹄疫疫苗是一种灭活的疫苗。二是猪瘟疫苗。常用猪瘟细胞活疫苗和脾淋活疫苗，60日龄前基础免疫可用细胞活疫苗，60日龄后加强免疫可用脾淋活疫苗。三是高致病性蓝耳病疫苗。生产实践证明，阳性猪群使用活疫苗效果更好。

自费疫苗主要有8种：一是猪链球菌病疫苗。目前较多使用的猪败血性链球菌病活疫苗对预防C群猪链球菌病有很好的效果，而对一些血清型流行比较复杂的地区可考虑使用猪链球菌多价灭活疫苗。二是日本乙型脑炎疫苗。用活疫苗可有效防止乙型脑炎的发生。三是猪细小病毒病疫苗。用灭活疫苗较好。四是仔猪大肠杆菌性腹泻波疫苗。目前常用且效果不错的有仔猪大肠杆菌基因工程四价灭活疫苗、仔猪大肠杆菌基因工程三价灭活疫苗、仔猪大肠杆菌基因工程二价灭活疫苗等。五是病毒性腹泻疫苗。常用的疫苗有猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻二联灭活疫苗、猪传染性胃肠炎和轮状病毒二联活疫苗等。六是猪喘气病疫苗。用进口的猪喘气病灭活疫苗可取得满意效果。七是副猪嗜血杆菌病疫苗。可选用油乳剂灭活苗。八是猪伪狂犬病疫苗。用猪伪狂犬病活 疫苗效果更佳。

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1PEA的基础研究概述

中外学者对PEA的研究已有将近40年的历史，早期的研究大部分集中在其分子结构及各部分结构的功能等方面。20世纪90年代以来，随着基因工程技术的飞速发展和分子生物学方法的逐步完善，从绿脓杆菌的基因组全序列入手，对其基因序列与功能的相关性以及利用这一相关性所展开的开发研究得到进一步深化［2］。

1.1PEA的结构和功能PEA是613肽的单链毒素蛋白，分子量为66MD，由信号肽和常用肽构成。其常用肽由3个结构功能区组成。功能区Ⅰ又分为大区Ia(第1～252位氨基酸)和小区Ib(第365－399位氨基酸)。三个功能区因其特异的氨基酸序列、分子结构及在肽链上的不同位置决定其分别同时行使其细胞毒性所必需的三种不同功能。区Ⅰ和区Ⅲ(第400～613位氨基酸)分别处于PEA分子的氨基端(N端)和羧基端(C端)，分别行使细胞结合功能和ADP－核糖基化作用。区Ⅰ的细胞结合功能主要通过区Ⅰa与靶细胞表面受体结合来实现，区Ⅲ因其含有在三级结构中形成折叠时起决定作用的8个半胱氨酸和4个双硫键而使其成为PEA发挥细胞毒性的关键功能区。目前的研究表明，区Ⅰb的大部分即使缺失也不会影响PEA的生物学活性，由此推断其在PEA细胞毒性中的确切作用尚不明确。功能区Ⅱ(第253～364位氨基酸)包含6个连续的α螺旋，有助其实现毒素的跨膜转位功能。

1.2PEA的产生、分离、纯化和鉴定PEA是绿脓杆菌在其生长增殖过程中产生的一种重要代谢产物，大多数体绿脓杆菌菌株都会生成PEA。但在其液体培养基中PEA含量少，浓度低，提取相当困难。而且不同的绿脓杆菌菌株、不同培养基成分及培养条件等也会影响PEA的合成［3］。分离及纯化方法和步骤的微小差异对PEA的纯度和收率可能产生较大影响，工业化生产的分离纯化方法因考虑到生产规模、操作的方便程度以及生产成本等诸多因素也会与实验室方法有所不同。

1.2.1PEA的培养方法P.V.Liu首先发现PA－103为绿脓杆菌外毒素高产菌株，并认为它是不产生蛋白酶或很少产生蛋白酶的菌株，此后被公认为PEA标准生产株。P.V.Liu经实验研究报道了提取PEA的培养方法，即利用胰蛋白酶大豆肉汤透析液作培养基，经培养、离心，取其上清液即为粗毒素。第三军医大学的学者用胰酶酪蛋白大豆肉汤培养基(Trypticsoybroth，TSB)，还有学者用TSA甘油培养基振荡培养绿脓杆菌PA103株，经流水透析、离心，取其上清液制成粗毒素［4］。有报道称，铁离子对绿脓杆菌的生长起到一定的促进作用，而对其代谢过程中产生PEA却有一定的抑制作用［5］。因此，有学者采用细菌生长培养基中加入铁离子，经离心洗涤2次后转换到去除铁离子的产毒培养基中继续培养，从而解决绿脓杆菌生长需铁而PEA产生受铁抑制的矛盾，使PEA产量大幅度提高。军事医学科学院微生物流行病研究所梁小兵等为了提高PEA的产量，采用了两代种子活化法［6］。在生长培养基中加入葡萄糖成分促进绿脓杆菌生长，在产毒培养基中加大甘油含量从而增加PEA的生成，同时在产毒培养基中加入少量NTA防止PEA的迅速降解，保证产毒水平不低于国外报道水平，培育时间比国外学者报告的18h缩短4～6h。

1.2.2PEA的分离、纯化和鉴定P.V.Liu通过在粗毒素中加入醋酸、加入饱和硫酸铵、DEAE纤维素柱层析、SephadexG－200柱层析等步骤得到纯化PEA;Callahan提出将粗毒素经薄膜超滤法浓缩，再经羟基磷灰石吸附层析、DEAE纤维素离子交换层析、葡聚糖G－150凝胶过滤层析等四步纯化法精制了毒素;刘小明等用DE－52纤维素阶段洗脱、硫酸铵分级沉淀、SephadexG－25除盐、DE－52纤维素梯度洗脱、SephadexG－200分子筛层析等四步纯化了PEA［7］，刘启富等用70%饱和硫酸铵沉淀SephadexG－100柱层析，DE－52柱层析，羟基磷灰石柱层析制备PEA［4］。之后有学者提出用聚丙烯酰胺凝胶电泳法纯化毒素。但规模生产所用的毒素纯化方法还需将DEAE纤维素吸附、饱和硫酸铵沉淀、梯度洗脱、羟基磷灰石柱层析等步骤结合起来才能得到较高收率的纯PEA。PEA的鉴定通常采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS－PAGE)方法。在SDS－PAGE电泳图谱上，PEA提取物呈现一条主要带，相对分子质量为66MD。同时用PEA抗血清作免疫印迹分析，得到的抗原性和分子量结果均与文献报道一致，即可证实纯化的蛋白为PEA。

2PEA重组毒素的研究进展

免疫毒素由具有导向能力的“载体”和具有细胞毒性的“弹头”以一定的连接方式偶联而成。因其兼有抗体的特异性和毒素的细胞毒作用，所以能够通过载体准确找到靶细胞，用其携带的具有细胞杀伤能力的毒素定向攻击肿瘤细胞，而对正常组织不产生杀伤作用，因此被形象地称作“生物导弹”。

2.1对抗体的研究单链抗体蛋白的分子量很小(25kD)，使其很容易穿过血管组织和致密的肿瘤屏障，进入实体瘤周围的微循环。将单链抗体与毒素基因重组，由具有导向作用的抗体将毒素携带并导入靶细胞，对靶细胞进行特异性杀伤。单链抗体与肿瘤抗原的结合有极强的特异性，并具有较低的免疫原性，而且单链抗体免疫毒素生产工艺简单，易于大量生产，是临床治疗肿瘤的理想药物。但是许多抗原抗体的结合作用都与结合部位相关，从而限制了单价单链抗体的应用。为了将单链抗体更好地应用于临床，可引入亮氨酸拉链、半胱氨酸及α－螺旋等结构，将单价单链抗体加以改造，构建成双价单链抗体分子(dsFv)。dsFv不仅稳定性更强，还具有与单价单链抗体相同的特异性和很强的杀伤细胞毒素活性。另有学者为了降低抗体的鼠源性，增强其亲和性，将具有较强特异性和亲和力的鼠类抗原加以改造，制成具有完整抗体结构的人－鼠工程抗体，应用于临床将是更加实际有效的方法，也是重组毒素抗体研究的发展方向。

2.2对毒素的研究生物导弹(重组毒素)常用的弹头(毒素)有两类:一类是植物毒素，包括苦瓜毒素(MD)、篦麻籽毒素(RT)、相思子毒素(abrin)等。另一类是细胞毒素，包括白喉毒素(DT)、绿脓杆菌外毒素(PE)。绿脓杆菌外毒素A因其极强的细胞毒性通常被用作重组毒素的“弹头”部分，其毒性本质是它能够催化真核细胞延伸因子－2的ADP核糖基化，阻止肽链延长中断细胞蛋白质合成而行使细胞毒作用。重组免疫毒素常用的绿脓杆菌外毒素是PE40，它是将PE分子去除Ⅰa区产生的。将PE40和特异性抗体相连接制成重组毒素，对受体细胞具有强烈杀伤性。但此类免疫毒素有实体瘤穿透率低，体内半衰期短的弊端，并且免疫毒素本身具有一定的毒副作用。因此，学者们应用基因工程手段通过改造PE分子结构来改善重组毒素的性状。目前应用于重组毒素的绿脓杆菌外毒素的突变体有PE38、PE38KDEL、PE35等几种［8］。这些衍生物虽然减少了非特异结合，但仍会对正常细胞和组织造成伤害。一些免疫毒素由于半衰期较短，会严重损害血管内皮细胞，造成血管渗漏综合症(VascularLeakSyndrome)。目前，已有学者对重组毒素蛋白的质控方法和质量标准进行了研究，为重组蛋白的批量生产和临床应用奠定了基础。史新昌等采用结晶紫比色法和反相高效液相色潜法(RP－HPLC)分别测定GP38蛋白的生物学活性和纯度，建立人性腺激素释放激素类似物－PEA功能片段重组蛋白GP38的质量标准和质控方法，不仅可用于GP38蛋白产品的常规检定，还可为其他重组蛋白的检定提供理论依据［9］。

2.3存在的问题及前景展望重组免疫毒素的特异性较高，细胞毒活性较强，用于靶向治疗肿瘤不仅疗效好，而且副作用低，是一种前景广阔的癌症治疗药物。但其存在体内半衰期较短，血管渗漏综合征出现率高，免疫原性较高的弊端，而且目前所用的单克隆抗体多为鼠源性，人体使用后会产生抗鼠源单克隆抗体的抗体，这些因素都限制了免疫毒素的反复应用。重组毒素免疫原性高的根源在于其分子量较大，一般都在35kD以上，所以寻找小型毒肽替代PE40已经成为一种必然。用基因工程的方法，对抗体和毒素进行改造，使鼠源抗体人源化并弱化毒素免疫原性，是完善和发展重组毒素导向治疗的研究方向，可使免疫毒素成为攻克癌症顽疾的首选药物。一种新型基因工程免疫毒素是将毒素基因接入表达质粒，通过碱性的鱼精蛋白将质粒与scFv相互连接，scFv将质粒引导至靶细胞，通过预先设计可使毒素在胞内的表达受控于可诱导的或靶细胞特异性启动子。这种基因工程抗体可以有效弥补抗原的相对特异性不足，使毒素更有选择性地到达靶细胞。一种新型的胞内抗体以mRNA形式由逆转录病毒、腺病毒等载体送达到靶细胞，翻译成抗体，使某些肿瘤细胞基因蛋白失活。这种新型抗体免疫原性大大降低，可作为载体广泛应用于重组毒素。刘绮明等经过研究获得了PEA常用肽上各氨基酸残基与抗原性的相对关系数据;通过对PEA常用肽上的6个关键区域分别置换1～2个氨基酸的方法，显著降低了PEA的抗原性，为构建安全有效的免疫毒素的奠定了基础。

3绿脓杆菌疫苗的研究进展

3.1传统绿脓杆菌疫苗的研究传统的细菌疫苗多注重在刺激宿主产生抗体，以对抗病原菌或加强巨噬细胞的噬菌能力，进而阻止细菌在患者体内繁衍。

3.1.1内毒素蛋白多价疫苗敬德仲等从我国11个血清型和美国Fisher7个血清型绿脓杆菌菌株中提取内毒素蛋白，筛选出攻击耐受性最强的三种血清型的绿脓杆菌内毒素蛋白制成三价疫苗，绿脓菌素免疫耐受力为4～500LD50。经北京、天津、重庆、黑龙江等32家医院400余例临床疗效观察，治疗绿脓杆菌感染总有效率达83.7%。

3．1.2超免疫血浆的研究超免疫血浆用于绿脓杆菌易感者的预防和绿脓杆菌感染的治疗，如烧伤、创伤、手术后以及呼吸道、尿路等绿脓杆菌感染的预防及治疗。20世纪80年代，黑龙江省科学院微生物研究所与上海亚太输血中心、瑞金医院协作研制了人用绿脓杆菌超免疫血浆。经47例严重烧伤患者临床实验(治疗组26例，应用绿脓杆菌超免疫血浆;对照组21例，用常规治疗。)结果治疗组有1例死于绿脓杆菌感染(3.8%)，而对照组8例死于绿脓杆菌感染(38.1%)。卫生部成都生物制品研究所与中国人民第三军医大学研制的抗绿脓杆菌冻干免疫血浆经动物实验和临床使用，证明不仅对同群菌株攻击有良好的保护作用，而且对异群菌株攻击也有较好的保护作用。经临床应用于严重烧伤患者有效率为81.5%，应用于呼吸道感染病人有效率为90%。目前，冻干绿脓杆菌超免疫血浆的市场需求越来越大，有专门信息咨询机构定期对冻干抗绿脓杆菌人血浆行业的整体及其相关子行业的运行情况进行调研，并对其未来的发展趋势和前景进行分析和预测［10］。作为治疗绿脓杆菌感染的辅助制剂，抗绿脓杆菌冻干免疫血浆因其能有效对抗耐药菌株而得到更多专家学者的关注。

3.1.3脂多糖疫苗的研究绿脓杆菌脂多糖疫苗是由6个血清型菌株提取的脂多糖组成的联合疫苗，它可剌激机体产生体液抗体，增强嗜中性白细胞的吞噬功能。应用于231例绿脓杆菌感染症患者的临床治疗证明，这种疫苗对烧伤感染、中耳炎等绿脓菌感染病症的治疗总有效率达90%以上，对我国绿脓杆菌11个血清型标准株有较好的保护作用。该疫苗不仅安全性高、而且毒性和副作用小，是我国治疗绿脓杆菌感染症的一种新药［11，12］。

3.2绿脓杆菌多联疫苗的研究绿脓杆菌感染宿主的途径多种多样，产生的临床症状也各不相同，而绿脓杆菌在繁殖过程中所产生的多种有毒代谢产物，对各种临床症状也有不同程度的影响，尤其是绿脓杆菌的主要致病因子—外毒素A对机体的伤害最大。传统的几种绿脓杆菌疫苗因其抗体种类单一而不能有效预防和治疗绿脓杆菌外毒素A对机体造成的病害，无法对患者提供足够的保护作用。近年来，有学者尝试研究了一种包含了绿脓杆菌外毒素A、外膜蛋白、弹性蛋白和碱性蛋白所制备的类毒素等多成分的绿脓杆菌多联疫苗。此疫苗无毒性且抗原性稳定，在水貂和人类体内的初步测试，证实可以刺激宿主细胞产生抗体，中和绿脓杆菌产生的多种有毒代谢产物，而且可以增强巨噬细胞的吞噬功能。但这种多成分的疫苗不但制造麻烦，而且很难控制每种成分的比例、含量，在接种疫苗后，免疫的效果差异也很大。

3.3基因工程疫苗的研究绿脓杆菌外毒素A是绿脓杆菌致病的最重要的内在机制，严重感染绿脓杆菌但能够存活下来的患者，其体内的抗绿脓杆菌外毒素A抗体的浓度都很高;因感染而死亡的患者，其体内却含有较低浓度的抗绿脓杆菌外毒素A抗体。此外，免疫力低下的患者可以通过使用抗绿脓杆菌外毒素A抗体使自己免受绿脓杆菌感染的威胁。但是绿脓杆菌外毒素A的毒性很强，如何利用基因工程方法降低或消除PEA的毒性，发展更安全、有效的绿脓杆菌疫苗，是科学家的研究重点之一。

3.3.1PEA毒性的消除方法以往消除PEA毒性都是用福尔马林处理，使其蛋白变性，制成没有毒性的类毒素。再用类毒素免疫家兔，产生免疫应答后取兔血，血清即为抗PEA抗体。这种减毒方法仍有可能产生有害的毒素。因此就有科学家利用基因工程的技术让绿脓杆菌外毒素A的毒性消失，但仍然保留大部分抗原性，而成为无毒性的绿脓杆菌外毒素A类毒素。利用这种类毒素，可以有效刺激机体产生抗体，中和绿脓杆菌外毒素A的毒害作用。这比先前用福尔马林处理绿脓杆菌外毒素A制造类毒素疫苗的传统方法更安全，而且抗原性也较强。

3.3.2重组融合蛋白疫苗利用基因工程技术消除绿脓杆菌外毒素A的毒性区域，用绿脓杆菌的多种外膜蛋白替代这一区域，形成一种多成分绿脓杆菌疫苗，即重组融合蛋白疫苗。动物实验表明这种疫苗确实可以刺激宿主产生与细菌表面抗原结合的特异性抗体，并能够促进巨噬细胞的吞噬作用，还可以对抗外膜蛋白产生免疫力，能够抵抗所有不同血清型的绿脓杆菌的感染，因此是一种更有效的新型绿脓杆菌疫苗。

3.3.3基因工程亚单位疫苗基因工程亚单位疫苗(Subunitvaccine)是利用DNA重组技术，将编码病原微生物保护性抗原的基因导入受体菌(如大肠杆菌)或细胞，并在受体中高效表达，分泌保护性抗原肽链。将保护性抗原肽链提取出来，加入佐剂即制成基因工程亚单位疫苗。它能克服一些常规疫苗的缺陷，代表了疫苗发展的一个新途径［13］。

3.4PA－MSHA菌毛株疫苗绿脓杆菌－甘露糖敏感血凝(PA－MSHA)菌毛株疫苗常被称作“绿脓杆菌制剂”，是一种能全面提高及调整癌症患者的体液免疫和细胞免疫功能，增强抑制和杀伤癌细胞效应的新型细菌性免疫调节剂(或称PA－MSHA免疫调节剂)，是癌症患者理想的辅助治疗药物。这种疫苗常被用作急性白血病、恶性淋巴瘤、肺癌的辅助治疗药物，在乳腺癌的治疗上也取得了很好的疗效［14，15］。此外，英国研制出一种用于治疗绿脓杆菌感染的口服型疫苗。通过成人志愿者小人群临床试验证明，口服接种免疫后，血清IgA水平提高并能促进机体产生并增强吞噬绿脓杆菌的能力，口服适宜剂量的此疫苗在人体内是安全的并且具有免疫原性。此疫苗还有望治疗纤维囊肿病人，消除这些病人肺部寄生的绿脓杆菌，避免呼吸衰竭而导致的死亡。除了人用绿脓杆菌疫苗以外，还有学者对动物绿脓杆菌感染性疾病进行了发病情况和流行特点调查，研制了多种疫苗对抗绿脓杆菌的感染，其中以灭活菌苗为主。有学者利用绿脓菌外膜蛋白疫苗和基因工程疫苗有提供共同保护性抗原的优点，将其应用于预防水貂出血性肺炎上，取得了较好效果［16］。

4PEA的应用绿脓杆菌外毒素A除了具有“与抗体结合制成免疫重组毒素用于靶向治疗”以及“开发各种绿脓杆菌疫苗以预防和治疗绿脓杆菌感染”的用途外，在食品中绿脓杆菌的鉴定、癌症治疗及作为抗原携带蛋白生产去势疫苗等方面都有广阔的应用前景。

4.1在菌种鉴定和检测方面的应用目前绿脓杆菌菌种鉴定方法主要依据其生理生化特性用生物学方法实现，但该方法周期长，步骤多且复杂，使其在食品卫生领域绿脓菌的鉴定受到限制。北京农学院的艾启俊等应用PCR技术研究设计了一种鉴定食品中绿脓杆菌感染的方法。他们根据编码绿脓杆菌外毒素A基因设计引物，通过PCR方法扩增出外毒素A基因［17］。此方法可从金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、乳酸菌、大肠杆菌菌液异性地检出绿脓杆菌外毒素A基因。该方法操作简单、灵敏度高，可检测到含量为3cfu/mL的绿脓杆菌，同时还有快速、特异性强等特点，也可用作临床标本细菌感染中绿脓杆菌的鉴定。山东农业大学的高玲美等用过碘酸钠法将过氧化物酶标记抗PEA抗体(IgG)，制成酶标抗体，通过平板凝集实验法和酶标抗体ELISA法对照实验，对羊体内抗PEA抗体含量进行了检测。结果证明，酶标抗体ELISA法检测的抗体效价要比平板凝集实验法平均高出2个滴度，表明制备的PEA酶标抗体具有灵敏度高、特异性强的优点［18］。这种技术已被开发制成人绿脓杆菌外毒素A(PEA)酶联免疫试剂盒，并已广泛应用于样品中绿脓杆菌外毒素A浓度的检测。

4.2在动物生育调控方面的应用绿脓杆菌外毒素A是一种有效的抗原携带蛋白，藉由绿脓杆菌外毒素A能够携带蛋白质的特性，可将其应用到除PEA以外的其它不同疫苗的研究上，以提升该抗原的免疫效果。例如利用重组DNA的方法，把去毒性的绿脓杆菌外毒素A作为携带蛋白与促性腺素释放激素(Gonadotropin－releasinghormone，GnRH)接合，用细菌作为生产去势疫苗的载体，免疫后的动物都能够产生很强的抗GnRH的抗体，抑制该动物的性腺发育和生殖功能。与外科手术去势的方法相比较，去势疫苗不仅方便有效、简单易行，而且降低了对动物机体的伤害和去势成本，是一种具有发展前景的去势手段。

4.3在癌症治疗上的应用对于癌症的治疗，现行的放疗和化疗方法没有特异性，对人体的伤害很大。而靶向重组毒素因其特异性强，副作用小，成为必然替代放疗和化疗方法治疗癌症的新型药物。目前，利用重组毒素治疗癌症治疗的研究已在国内外专家的努力下取得了实质性进展，但大多数处于动物实验阶段，还没有广泛应用于临床。

4.3.1PEA细胞毒作用在癌症治疗上的应用利用绿脓杆菌外毒素A极强的细胞毒作用，可将其用作靶向重组毒素的弹头部分。张鸿等研究了促黄体激素释放激素(LHBH)基因与绿脓杆菌外毒素A(PE40)基因重组蛋白(LHBH－PE40)对非小细胞肺癌细胞A549的毒性作用，发现LHRH－PE40可以诱导A549细胞凋亡［19］。燕翔等通过实验研究得到基因重组转化生长因子α－绿脓杆菌外毒素融合蛋白(TGFα－PE40，简称TP40)对人膀胱癌细胞的生长具有剂量、时间依赖性抑制作用的结论［20］。姜洋等经研究发现重组人促黄体激素释放激素－绿脓杆菌外毒素A(LHRH－PE40)对过度表达LHRH受体的胃癌均具有特异有效的抗肿瘤活性［21］。还有更多的学者利用基因工程技术合成了用于治疗各种癌症的重组毒素，如新型肝癌免疫毒素A54－PE40KDEL［22］，并通过动物试验或体外试验证实具有毒杀癌细胞的作用。此外，有学者利用PEA细胞毒作用制成重组免疫毒素，用以治疗其他疾病。李胜涛将与FcεRI高度结合的人IgE的Fc片段作为靶向部份与PEA偶联，组成靶向免疫毒素，对肥大细胞有凋亡作用，用以治疗过敏性疾病［23］。

4.3.2PEA作为蛋白质携带载体在癌症治疗上的应用利用绿脓杆菌外毒素A能够携带蛋白质或DNA进入细胞中的特殊功能，还可将其用作载体开发出极佳的基因治疗工具或蛋白质治疗药物。马超等利用外毒素结构域Ⅰa基因表达蛋白的佐剂效应，构建绿脓杆菌外毒素A与Ⅱ型单纯疱疹病毒糖蛋白嵌合蛋白表达载体，经动物实验证实，此嵌合表达蛋白可诱导产生抗HSV－2特异性抗体并具有较强的免疫原性［24］。刘艳华等应用绿脓杆菌外毒素的结构域Ⅱ(PEⅡ)的转膜效应，构建了以Ⅰ型促性腺激素释放激素(GnRHⅠ)为导向部分，以丝瓜毒素luffinS2为毒性部分的重组嵌合毒素GnRH－PEⅡ－luffinS，体外实验证实其对肿瘤细胞有显著杀伤作用［25］。还有学者成功地构建了毒性基因缺失的PEA与人组蛋白H4融合基因的原核表达载体，为进一步表达并获得大量的融合蛋白奠定了基础［26］。

4.3.3PEA的超抗原特性在治疗癌症上的应用PEA是由绿脓杆菌分泌的一种可溶性蛋白质，可大量激活T淋巴细胞，属外源性超抗原。超抗原对免疫系统的影响很大，无论是急性效应(包括食物中毒和中毒性休克综合征)还是长期效应(包括自身免疫性疾病和免疫缺陷)通常对机体都是有害的，但如果合理利用其“能迅速激活大量T淋巴细胞”的特性，超抗原可以增强机体的免疫反应，对机体产生积极的作用。利用PEA的这一特性，学者们将其应用于肿瘤治疗中可获得明显的疗效。PEA超抗原通过大量激活细胞毒性T淋巴细胞(CTL)与NK细胞，使得这两种细胞参与的免疫细胞介导的杀肿瘤细胞活性相应增强。此外，被激活的大量T淋巴细胞会分泌一种具有抗增殖作用的IFN2γ，也促进了这种抗肿瘤活性的增强。重组毒素除了应用在抗肿瘤、治疗自身免疫性疾病等方面，还在其他疾病的治疗或预防上发挥作用。有学者将甲型流感病毒M2蛋白胞外区与铜绿假单胞菌外毒素A相融合，并构建融合蛋白的原核表达载体，免疫小鼠后再用流感病毒A/PR/34/8株攻击小鼠。经检测发现，这种方法能够抑制病毒在肺内的复制。此项研究为甲型流感病毒广谱疫苗的进一步研发打下了基础［27］。

篇(7)

虽然血源性乙肝疫苗在控制乙肝方面发挥了重要作用，但它并非十全十美，应用之初，就显露了其本身的一些缺点。其一，来源有限，无法大规模稳定生产；其二，在HBsAg 阳性血浆采集、运输和加工过程中，有可能造成环境污染及乙肝病病毒传播；其三，尽管疫苗生产过程中采用三步灭活工艺，应用后至今未发展1人因注射疫苗而发病，但极难确保所有潜在性致病因子（特别是未知的致病因子）均被灭活；其四，生产中需要较高的纯化抗原技术及灭活要求，成本较高，并影响疫苗的免疫原性。有鉴于此，并影响疫苗的免疫原性。有鉴于此，血源性乙肝疫苗只能作为一种过度性疫苗，尚需开发新型疫苗。

70年代末期，在乙肝病毒的基因序列已基本弄清的基础上，不少国家开始研究基因工程疫苗。1986年，美国一家公司用酵母表达的HBsAg基因工程疫苗投产。此后，重组细胞疫苗、多肽疫苗等。也相继问世。上述疫苗的制备不需要合适的血浆，也不需要采取针对致病因子的灭活措施，因而可以高效稳定地大规模工业化生产，且安全性更高，价格较便宜。从实际接种的效果看，基因工程疫苗的保护率与血源性疫苗相同，其抗体阳转率在95%以上，母婴传播阻断率在85%以上，能够显著降低乙肝病毒的感染率和携带率，且无严重不良反应，是安全而有效的免疫制剂。

与此同时，国内外对乙肝疫苗的接种方法进行了大量研究，目前各国的接种方案就是根据这些研究成果制定的。1991年我国颂布了乙肝免疫方案：

1. 接种对象：

对乙肝的深入研究证实，感染乙肝病毒的年龄越小，成为慢性持续性感染的可能性越大。如果在1岁以内感染，将导致70-90%的婴儿成为乙肝病毒携带者；如果在2-3岁感染，将有40-70%的儿童成为携带者；如果在4-6岁时感染，有10-40%的儿童成为携带者；如果在7岁以上感染，只有6-10%变成携带者。也就是说，新生儿时期预防乙肝效果最好。

因此，我国的乙肝免疫方案要求全体新生儿接种乙肝疫苗，在条件许可的情况下扩大到学龄前儿童。

2. 免疫途径：

乙肝疫苗的接种途径包括肌肉、皮下和皮内注射数种；肌肉注射又分上臂三角肌和臀部两种。目前多采用肌肉注射方法，注射部位以上臂三角肌为宜。

3. 免疫程序与剂量：

我国的乙肝免疫方案规定，接种程序为0、1、6月三针间隔接种。"0"指新生儿出生后24小时内的第一针，对其他儿童或成年人则为第一针起始时间；"1"为间隔1个月接种第三针；"6"指第一针后的6个月接种第三针。应当强调，三针疫苗必须按时注射，特别是第一针一定要及时注射，应用越早，效果越好；第二针如果因故未能按规定时间注射，略晚几天也可以，但不得超过8周；第三针为加强免疫，也应按时接种，因故提前1个月或延后1-2个月亦可，但最迟不能超过10个月。

4.加强接种问题：